60ª Reunião Anual da SBPC

INTRODUÇÃO:

Os estudos envolvendo análises de comunidades bacterianas através de técnicas de cultivo representam apenas uma pequena fração da diversidade genética e da complexidade das comunidades microbianas de solo. As novas técnicas moleculares baseadas na amplificação de ácidos nucléicos por Reação de Polimerase em Cadeia (PCR) permitem a amplificação de grandes quantidades de DNA genômico e a comparação de diferentes comunidades microbianas. A análise de T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Lenght Polymorphism) ganhou popularidade nos últimos anos devido à alta reprodutibilidade e o acesso a um grande número de unidades taxonômicas operacionais. Esta técnica já foi empregada para caracterizar as comunidades microbianas em diferentes ambientes, como solos de floresta, solos poluídos, sedimentos, estruturas de plantas, trato digestivo de minhocas, entre outros. O objetivo desse trabalho foi analisar a aplicabilidade do método no estudo da diversidade e estruturas de comunidades bacterianas de solos de manguezais, ambientes conhecidos e caracterizados como berçário e fonte de alimentos para peixes e outros animais, como também uma reserva rica e importante habitat para microrganismos, os quais são componentes essenciais da biota terrestre.

METODOLOGIA:

As amostras foram coletadas em dois ambientes de manguezais: Bertioga (SP), situado no litoral norte do Estado de São Paulo e Ilha do Cardoso (Cananéia - SP), situado no extremo sul do litoral paulista. No Laboratório de Biologia Celular e Molecular do Centro de Energia Nuclear na Agricultura (CENA-USP) foi realizada a extração do DNA total do solo com o Kit UltraClean Power Soil^TM (MoBio), seguindo o protocolo sugerido pelo fabricante. Após a extração, as amostras foram quantificadas em espectrofotômetro e uma alíquota do DNA concentrado foi diluída 10X para a utilização nas reações. As reações de PCR foram realizadas com um par primers universais para o grupo de bactérias, sendo eles: 27F (5’ AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 3’) e 1492R (5’ TACGGYTACCTTGTTAGGACTT 3’). Para a detecção de fluorescência na análise de T-RFLP, a extremidade 5’ do primer 27F foi marcada com 5-carboxyfluorescein (FAM). Os produtos de PCR foram digeridos com as enzimas Msp I e Hha I e os fragmentos terminais foram lidos em seqüenciador automático ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). A determinação do comprimento dos fragmentos terminais de restrição foi feita com software PeakScanner 1.0 e as análises estatísticas através do programa Canoco 4.5.

RESULTADOS:

A análise dos picos de fluorescência no software PeakScanner 1.0 revelou elevada riqueza de unidades taxonômicas operacionais (UTOs) mostrando complexas estruturas e alta diversidade nas comunidades bacterianas nos solos estudados. A Análise de Componentes Principais (PCA) foi realizada através do software Canoco 4.5 e mostrou diferenças estruturais nas comunidades bacterianas dos dois ambientes, reunindo as amostras em dois grupos diferentes, um para as amostras de Bertioga e outro para as amostras da Ilha do Cardoso. A topologia global do gráfico feito através das duas endonucleases foi muito similar, mostrando alta confiabilidade dos dados. O valor expresso pelo Índice de Shannon não demonstrou diferença significativa na diversidade das comunidades amostradas, revelando comparativamente, baixa distinção dos fragmentos terminais de restrição (T-RFs) identificados nos ambientes analisados nesta pesquisa.

CONCLUSÕES:

O método de T-RFLP apresentou dados relevantes que contribuíram com informações para a diversidade e estruturas de comunidades bacterianas em solos de manguezais. A utilização do seqüenciador automático ABI Prism 3100 Genetic Analyzer conseguiu detectar um alto número de unidades taxonômicas operacionais, analisadas através de programas estatísticos. O método de T-RFLP permitiu uma análise robusta e eficaz das comunidades bacterianas de solos de manguezais evidenciada pela facilidade na amplificação do DNA com primers universais, baixa onerosidade para realização da análise e alta reprodutibilidade.

Instituição de fomento: CNPq/Fapesp-Biota

Palavras-chave: T-RFLP, Diversidade, Bactérias

E-mail para contato: lwmendes@cena.usp.br