60ª Reunião Anual da SBPC

INTRODUÇÃO:

Os glicosaminoglicanos são heteropolissacarídeos que apresentam diversas funções, tais como: resistência à infecção, controle de água e eletrólitos, cicatrização, divisão e crescimento celular, adesão celular, manutenção da transparência córnea e atividade anticoagulante. Em invertebrados já foi identificada a presença de enzimas como glicosidases e sulfatases que atuam sobre glicosaminoglicanos sulfatados. A identificação e purificação dessas enzimas se prestam à necessidade de caracterizar quimicamente estes compostos originados de diferentes fontes e, que apresentam funções diversas ou ainda, produzir oligossacarídeos modificados quimicamente com a intenção de estudar as interações de determinadas regiões destas moléculas com proteínas específicas, como também as funções farmacológicas dos oligossacarídeos formados. Este trabalho objetiva identificar e purificar uma β-N-acetilglucosaminidase extraída de cabeças do camarão marinho Litopenaeus schimitti.

METODOLOGIA:

As cabeças dos camarões foram removidas e homogeneizadas em tampão acetato de sódio 0,1 M pH 5,0. Em seguida, centrifugadas e os extratos brutos utilizados para posterior fracionamento com sulfato de amônio em três etapas de saturação: 0-30% (FI); 30-50% (FII); 50-80% (FIII). A fração F-III da cabeça do camarão foi submetida à Cromatografia de troca iônica DEAE-Biogel onde a enzima foi eluída com tampão fosfato de sódio acrescido de cloreto de sódio na concentração de 0,2 M, em seguida estas frações foram reunidas e submetidas a uma Cromatografia de exclusão molecular Superose-12 sob sistema FPLC AKTA Purifier. Todas as etapas foram realizadas a 4ºC. O perfil de eluição protéica foi determinado por absorção a 280 nm. As atividades enzimáticas foram determinadas utilizando-se como substrato o PNF-N-acetil-beta-D-Glucosaminídeo durante 30 min a 37ºC (para o extrato bruto, F-I, F-II e F-III) e 3 horas a 37ºC (para as frações eluídas das cromatografias). O p-nitrofenol liberado foi lido a 405 nm em espectrofotômetro. As frações provenientes do Extrato Bruto, F-III, 0,2 M de NaCl da Cromatografia de troca iônica DEAE-Biogel e as eluídas da Superose-12 em sistema FPLC foram submetidas a SDS-PAGE a fim de se obter o grau de purificação e o peso molecular da β-N-acetilglucosaminidase.

RESULTADOS:

Os resultados iniciais, realizados com as amostras obtidas do fracionamento com sulfato de amônio, mostraram que, de todas as atividades encontradas, a β-D-N-acetilglucosaminidase foi a que mais se sobressaiu em todas as frações testadas. A fração F-III, por apresentar maior precipitação da enzima de interesse, foi submetida a uma cromatografia de troca iônica DEAE-Biogel e em seguida a coluna foi eluída com tampão fosfato de sódio acrescido com NaCl como descrito em materiais e métodos. A N-acetil-beta-D-glucosaminidase foi eluída no pico protéico a 0,2 Molar de NaCl. Após a obtenção da N-acetil-β-D-glucosaminidase na cromatografia de troca iônica DEAE-Biogel foi realizado um novo passo cromatográfico a fim de obter ainda mais pura a enzima. As frações eluídas a 0,2 M de NaCl desta coluna foram reunidas e aplicadas numa gel filtração no sistema FPLC, onde se pode observar que, a enzima N-acetil-β-D-glucosaminidase foi eluída em um pico único. Este resultado foi confirmado quando aplicou-se alíquotas destas frações em SDS-PAGE. Neste foi observado a presença de duas bandas protéicas bem evidentes. Após serem comparados os pesos moleculares aos obtidos através da exclusão molecular pode-se chegar a conclusão que a β-N-acetilglucosaminidase apresenta uma única banda de 36 kDa.

CONCLUSÕES:

Neste trabalho pode-se observar que a fração F-III (50-80%) da cabeça de camarão apresentou maior atividade da enzima N-acetil-beta-D-glucosaminidase. Na cromatografia de Troca Iônica DEAE-Biogel, a enzima N-acetil-beta-D-glucosaminidase apresentou maior atividade quando eluída nas frações correspondentes aos picos 0,2 M de NaCl e na cromatografia de Gel Filtração a enzima N-acetil-beta-D-glucosaminidase foi eluída em um pico único demonstrando boa purificação da enzima, resultado este confirmado após a realização da SDS-PAGE onde se verificou a presença de apenas duas bandas protéicas.

Instituição de fomento: UFRN e CNPq

Trabalho de Iniciação Científica

Palavras-chave: Invertebrados, Glicosidases, Purificação

E-mail para contato: robertagodone@hotmail.com