60ª Reunião Anual da SBPC

INTRODUÇÃO:

A purificação de proteínas do soro por cromatografia de afinidade tem sido vista pela indústria como uma operação necessária, uma vez que, proteínas altamente purificadas podem ser isoladas. Devido à facilidade em efetuar a separação, identificação e quantificação das espécies químicas, a cromatografia ocupa um lugar de destaque entre os métodos modernos de análise e purificação de proteínas. Ey e colaboradores (1978) descreveram um método para fracionamento de IgG do soro de camundongo em colunas de proteína A-Sepharose, variando-se o pH de eluição. A proteína A é uma proteína de superfície encontrada em amostras de Staphylococcus aureus, composta por uma cadeia polipeptídica com massa molecular de 58 kDa, responsável pela interação com a porção Fc da molécula de IgG. Existem três propriedades da proteína A muito importantes nos estudos imunocitoquímicos: a proteína A não muda a capacidade do anticorpo de unir-se ao antígeno quando ela está ligada na região Fc da IgG; a união antígeno-anticorpo pode romper-se facilmente reduzindo-se o pH; a proteína A renatura com facilidade, recuperando a capacidade de união com a porção Fc do anticorpo (YAVUZ et al, 2006).

METODOLOGIA:

Soros de gatos: foram obtidos de animais adultos saudáveis. Imunização de camundongos: Machos BALB/c foram imunizados com IgG de gato purificada (10 µg), via ip., semanalmente, por um mês. Fracionamento de IgG: Efetuado segundo Ey et al (1978), à partir de: soros de gatos normais; soro de camundongo anti-IgG felina. O grau de pureza da IgG purificada foi analisado em SDS-PAGE, após impregnação pela prata. Ensaio Imunoenzimático e Immunoblot: Foram utilizados para titulação da IgG de camundongo anti-IgG de gato. Para o ELISA, placas de poliestireno sensibilizadas com IgG de gato foram bloqueadas (PBS-leite 2%). Após lavagem, adicionou-se soro de camundongo imunizado em diversas diluições e incubou-se por 1h. Lavou-se a placa com PBS-tween e adicionou-se conjugado anti-IgG de camundongo marcado com peroxidase. Depois de incubação (1h) e lavagem, adicionou-se substrato e cromógeno. O bloqueio da reação foi feito com acido 2N e a leitura em leitor de ELISA (492nm). Para o “Immunoblot”, IgG de gato foi submetida a SDS-PAGE e transferida para membrana de nitrocelulose. Após bloqueio, incubação com diferentes diluições de IgG de camundongo anti-IgG de felino, e revelação com conjugado e mistura cromógeno-substrato, determinou-se o título do antissoro para “immunoblot”.

RESULTADOS:

O “pool” dos soros de F. domesticus normais e o antissoro de camundongo anti-IgG de F. domesticus, foi fracionado em coluna de Proteína A-Sepharose, utilizando-se tampão glicina pH 2,6. A eletroforese do material eluido em gel de poliacrilamida demonstrou a presença de duas bandas de 50 e 25 kDa, correspondentes as cadeias pesada e leve da IgG de F. domesticus. IgG de camundongo anti-IgG de F. domesticus apresentou título de 1/ 204.800 na reação de ELISA, e de 1/4000 no immunoblot. Estes resultados demonstram a viabilidade da produção de antissoros direcionados para imuneglobulinas de espécies pouco convencionais.

CONCLUSÕES:

- IgG de F. domesticus apresentou boa afinidade para a coluna de proteína-A Sepharose, permitindo sua purificação com pouca degradação; - O antissoro produzido em camundongo apresentou alto título de anticorpos na reação de ELISA, e títulos menores no immunoblot.

Instituição de fomento: CNPQ

Trabalho de Iniciação Científica

Palavras-chave: IgG de Felis domesticus, Purificação, Cromatografia

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