60ª Reunião Anual da SBPC

INTRODUÇÃO:

A capacidade regenerativa do fígado frente a lesões teciduais tem sido alvo de diversos estudos. Considera-se que o processo regenerativo ocorre a partir da interação entre três compartimentos celulares: hepatócitos, progenitores intra-hepáticos e medula óssea. O papel de cada um destes compartimentos celulares varia de acordo com o tipo de lesão hepática estabelecida. O conhecimento do papel fisiológico da medula óssea neste processo pode ajudar no desenvolvimento de novas terapias celulares. Para tanto, a utilização de animais quiméricos de medula óssea tem sido de grande valia. Estes animais são gerados a partir da depleção das células da medula óssea por irradiação letal de animal selvagem seguida de reconstituição com células de doador transgênico ou transplante inter-sexo. Deste modo, células derivadas da medula óssea da quimera podem ser rastreadas nos diversos tecidos do corpo, já que possuem uma característica que as distingue das demais. A hipótese de que estímulos lesivos diferentes seriam capazes de promover diferentes graus de recrutamento e contribuição de células medula óssea na regeneração hepática levou ao desenvolvimento deste estudo, o qual buscou estudar e comparar a participação da medula óssea na regeneração do fígado em diferentes modelos experimentais de lesão hepática.

METODOLOGIA:

Utilizou-se camundongos fêmeas C57Bl/6 selvagens e machos transgênicos para proteína verde fluorescente (EGFP). Camundongos quiméricos foram obtidos a partir da irradiação letal (600rad) dos C57Bl/6, seguida da infusão de 3x108 células totais de medula óssea (MO) de machos EGFP, via plexo orbital. Após 2 semanas, MO dos animais quiméricos foi coletada para confirmação, através de citometria de fluxo, da reconstituição medular pelas células do doador EGFP. Os animais quiméricos foram divididos em 5 grupos (A-E). A-B: os animais receberam CCl4 diluído a 20%, via orogástrica (2 vezes por semana) e etanol diluído a 5% na água continuamente. O grupo A (lesão aguda) foi sacrificado após 30 dias e o grupo B (lesão crônica) após 4 meses. C: os animais foram infectados com Schistosoma mansoni por via transcutânea (30 cercárias / animal) e sacrificados após 3 meses. D: os animais foram submetidos à cirurgia de hepatectomia parcial de 60% e sacrificados após 15 dias. E: os animais não receberam intervenções e foram sacrificados simultaneamente aos experimentais. Todos os grupos foram submetidos a análises quantativas e qualitativas (co-marcações) de imunofluorescência com a utilização de anticorpos específicos (CK18, OV-6, Albumina, GFP). As células positivas foram quantificadas manualmente em 5 imagens por animal, obtidas aleatoriamente e com fundo cego. Os resultados foram analisados utilizando o teste t e considerados significativos se p<0,05.

RESULTADOS:

O protocolo realizado para obtenção de animais quiméricos demonstrou-se eficaz, tendo sido observado 0% de mortalidade. Esta observação sugere que a infusão de células do doador EGFP foi capaz de proteger os animais dos efeitos da irradiação letal, a partir do repovoamento da MO. Isto foi comprovado através de citometria de fluxo, com níveis de expressão de EGFP semelhantes entre animais transgênicos EGFP (77,14%) e animais quiméricos (71,51%). Neste primeiro momento, foi realizada a análise do grupo A. Observou-se, por imunofluorescência, a presença de células EGFP, em pequenos números, nos sinusóides hepáticos dos animais sem lesão hepática. O tratamento agudo com tetracloreto de carbono foi capaz de induzir a migração de um número 2 vezes maior de células para o fígado, as quais se dispunham predominantemente em regiões perivasculares. O grupo de camundongos tratados com tetracloreto de carbono também exibiu número 3 vezes maior de células ovais (OV-6+) do que os controles sem lesão. Observou-se que metade células OV-6+ co-expressavam EGFP, demonstrando origem da medula óssea. Células EGFP+ co-expressando CK-18 foram vistas em grande número nas mesmas regiões, bem como algumas células co-expressando albumina, ambos marcadores encontrados em hepatócitos. A capacidade de células de MO em co-expressar marcadores hepáticos neste modelo experimental pode ser explicada por duas hipóteses principais: transdiferenciação e fusão, não passíveis de serem testadas com as técnicas utilizadas neste estudo.

CONCLUSÕES:

O presente estudo demonstrou a capacidade de células de medula óssea em migrar, se inserir no parênquima hepático e expressar proteínas específicas do fígado em modelo experimental de lesão aguda por tetracloreto de carbono. A conclusão dos estudos utilizando os demais grupos experimentais trará um melhor entendimento acerca dos fatores e condições patológicas envolvidas no recrutamento e participação das células da medula óssea na regeneração hepática. Este conhecimento trará informações importantes para o desenvolvimento de terapias celulares nas doenças hepáticas.

Trabalho de Iniciação Científica

Palavras-chave: Células-tronco, Medula óssea, Fígado

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