60ª Reunião Anual da SBPC

INTRODUÇÃO:

A Mannose-Binding Lectin (MBL), uma proteína pertencente à família das “colectinas” e codificada pelo gene MBL-2, é sintetizada pelo fígado e secretada na corrente sanguínea. Apresenta grande importância no reconhecimento imunológico de microrganismos invasores, integrando uma das vias de ativação do Sistema Complemento conhecida como Via da Lectina. A opsonisação microbiana pela MBL conduz, entre outros eventos, à fagocitose dos mesmos, além de atuar na modulação de diversos mediadores inflamatórios. Os níveis séricos reduzidos da MBL e a existência de formas variantes desta, influenciam a susceptibilidade e a patogênese de diversas infecções. O gene MBL-2 apresenta três polimorfismos conhecidos na região 5’ não traduzida (-550G>C, -221G>C e +4C>T), que afetam os níveis de expressão da MBL, e três polimorfismos no éxon 1, que resultam em alterações de aminoácidos (R52C, G54D e G57E) e, conseqüentemente, reduzem a funcionalidade da mesma. Estas são conhecidas como variantes D, B e C, respectivamente, denominando-se A o tipo selvagem. O presente estudo objetivou definir e padronizar uma metodologia para a análise do polimorfismo no códon 54 (GGC>GAC) do gene MBL-2.

METODOLOGIA:

Os procedimentos de extração e purificação de DNA genômico humano foram aplicados a amostras de sangue periférico, dos próprios integrantes do projeto, coletadas e mantidas em FTA-Card®, segundo instruções do fabricante (KLINE et al., 2002). A partir do DNA extraído, um segmento do gene MBL-2, correspondente ao éxon 1 e parte da região 5’ não traduzida, foi amplificado via PCR. Cada tubo, contendo amostra ou controle negativo, recebeu 50uL de solução, preparada em cabine de segurança de uso específico, contendo 50pmol dos iniciadores, 200uM dNTP’s, 1,5mM MgCl2, 1U PlatinumTaq® polimerase (Invitrogen, Carlsbad, CA), tampão de reação (Invitrogen) e água grau PCR. A termociclagem foi realizada em aparelho MJ PTC100 (Watertown, MA). Os produtos de amplificação (“amplicons”) foram submetidos à digestão (“Restriction Fragment Length Polymorphisms”; RFLP) pela endonuclease BanI (New England Biolabs, Beverly, MA). A incubação foi realizada à 37ºC, durante 2 horas. Os produtos de PCR e RFLP foram submetidos à eletroforese (100V) em gel de agarose a 1%, por 1 ou 2-3 horas, respectivamente, seguido de exposição à luz ultravioleta e digitalização (MiniBis, DNR Bioimage Sytems).

RESULTADOS:

Confirmou-se os padrões de tamanho de fragmentos esperados e correspondentes a cada um dos três genótipos (homozigoto selvagem = 83 e 1034pb; heterozigoto = 83, 1034 e 1117pb; homozigoto mutante = 1117pb). Anteriormente, outros autores já haviam alcançado sucesso na definição de metodologia baseada em PCR/RFLP para estudos de prevalência do polimorfismo no códon 54 (Garred et al., 1992; Gong et al., 2007; Matsushita et al., 1998; Sasaki et al., 2000), porém empregando outros iniciadores de PCR. Alternativamente, outras abordagens tecnológicas foram propostas e desenvolvidas para a análise dos polimorfimos do gene MBL-2, como as técnicas “MassARRAY” e “Taqman” (Gong et al., 2007) e PCR-SSPs (Boldt & Petzl-Erler, 2002).

CONCLUSÕES:

A metodologia proposta para a análise das variantes genotípicas do códon 54 do gene MBL-2 humano foi padronizada e, portanto, conclui-se que poderá ser empregada na investigação da possível associação entre o polimorfismo descrito e diferentes condições (susceptibilidade, história natural, resposta à terapia, entre outras) relacionadas com patologias de grande relevância na atualidade, como as hepatites B e C, SIDA, influenza, e infecções bacterianas como as causadas por Staphylococcus aureus e Neisseria meningitidis.

Instituição de fomento: FAP/ UNIVILLE

Trabalho de Iniciação Científica

Palavras-chave: Gene MBL-2, Mannose-binding Lectin, Polimorfismos genéticos

E-mail para contato: tagirrani@bol.com.br