60ª Reunião Anual da SBPC

INTRODUÇÃO:

Neuropilina 1 (NP1) é uma glicoproteína transmembranar cujo os domínios extracelulares interagem com uma semaforina de classe 3 (Sema3a). Descrita primeiramente como um receptor neuronal importante na orientação axonal, que é resultado da interação de NP-1 com seu ligante quimiorepulsor Sema3a, NP1 é também importante na sinapse entre células dendríticas e células T periféricas. Foi demonstrado pelo nosso grupo de trabalho que NP1 e Sema3a são expressas no timo humano tanto em células epiteliais quanto em timócitos. A compreensão do papel funcional de NP1 no timo é restringida pela falta de um modelo animal experimental que se assemelhe à situação humana. Além disso, tanto as observações do papel de NP1 na sinapse imunológica quanto os dados obtidos em células humanas nos conduziram à hipótese de que esta molécula poderia ter um papel importante na fisiologia do timo, podendo estar envolvida na migração de timócitos e eventualmente contribuindo para a formação da sinapse imunológica no timo; por exemplo, entre timócitos e células epiteliais tímicas. Por estas razões, investigamos a viabilidade do camundongo Balb/c no estudo de NP1 no timo, utilizando a célula epitelial nurse tímica como modelo de interação celular entre timócito e microambiente tímico.

METODOLOGIA:

Para isolamento das células nurse tímicas (TNCs), os timos dos camundongos (fêmeas Balb/c de 3 a 4 semanas) foram retirados e submetidos a duas digestões enzimáticas. Após, foi feita uma sedimentação da suspensão celular sobre um gradiente soro bovino fetal a 70% em PBS. Para análise in situ da expressão de NP1, os cortes de timo foram marcados com anticorpos monoclonais (anti-NP1, anti-citoqueratina) e analisados por microscopia de fluorescência e por microscopia confocal a laser. Para análise da expressão de NP1 e Plexina A1 na membrana celular e de Sema3a intracelular, timócitos extraídos por dissociação mecânica do timo e TNCs recém isoladas foram marcados com anticorpos monoclonais. As amostras foram lidas em um citômetro de fluxo e os dados calculados no software Win MDI. Para análise da liberação de timócitos, TNCs recém isoladas, após 48 horas de cultivo, foram separadas em 4 grupos: controle (RPMI); Sema 3a a 50 ng/ml; Sema 3a a 100 ng/ml; e Sema 3a a 150 ng/ml. Após um período de 3 horas, as células foram fixadas, coradas e fotografadas no microscópio invertido. A contagem dos dois estágios das TNCs - estágio1, células com timócitos; e estágio2, células com características de células epiteliais e livres de timócitos – foi realizada com auxílio do software photoshop.

RESULTADOS:

Em cortes de tecido, observamos uma expressão maior de NP1 na região medular do timo quando comparada ao córtex, tanto por microscopia de fluorescência quanto por microscopia confocal. Foi possível definir a colocalização de NP1 com a citoqueratina em alguns pontos do corte, indicando a expressão de NP-1 em células epiteliais. Os dados obtidos através da citometria de fluxo demonstraram que Plexina A1 e NP1 são expressos na superfície da membrana de TNCs (cerca de 60%), enquanto timócitos apresentam baixa positividade para estes receptores (cerca de 6% NP1+ e 17% Plexina A1+). Sema3a não foi detectada em TNCs recém isoladas, mas foi positiva em timócitos (cerca de 6%). Dentro das subpopulações de timócitos, as células CD8+CD4- apresentaram maior positividade para NP1, Plexina A1 e Sema3a quando comparadas às outras três subpopulações. No que diz respeito aos experimentos de liberação, não constamos nenhuma alteração evidente do número de células nos diferentes estágios quando comparamos os grupos tratados com Sema3a entre si e os mesmos com grupo controle.

CONCLUSÕES:

Os dados obtidos até o presente nos permitiram concluir que NP1 e Plexina A1 são expressas tanto em timócitos quanto em células nurse tímicas murinas. Sema3a está expressa em timócitos, no entanto, dentro de nossas condições experimentais, não foi possível detectarmos esta proteína em TNCs recém isoladas. No que concerne à expressão de NP1, podemos também concluir que nossos resultados se assemelham com os dados obtidos para o timo humano. Quanto aos estudos funcionais, podemos concluir que, dentro das condições experimentais, Sema 3a não influenciou no processo de liberação de timócitos por células nurse tímicas.

Instituição de fomento: PIBIC/FIOCRUZ

Trabalho de Iniciação Científica

Palavras-chave: Neuropilina 1, Timo, Interações Imunoneuroendócrinas

E-mail para contato: anninhayorio@hotmail.com