60ª Reunião Anual da SBPC

INTRODUÇÃO:

A arginase é uma enzima presente em mamíferos e protozoários, envolvida no ciclo da uréia. Ela catalisa a hidrólise da L-arginina em L-ornitina e uréia e compete com a óxido nítrico sintase (NOS II) pelo mesmo substrato. Por ação da enzima ornitina descarboxilase (ODC) a L-ornitina é convertida a putrecina que é precursora de poliaminas, essa síntese é essencial para o crescimento protozoários como Leishmania. A resistência ou susceptibilidade a infecção é dependente da resposta imunológica. Quando a resposta é via Th1, indutora da NOS II, leva a morte do parasita mediada por ação citotóxica do óxido nítrico. Se a resposta é mediada por células Th2, indutoras da arginase I, ocorrerá o crescimento do parasita. A busca por inibidores da arginase pode levar ao descobrimento de novos fármacos para o tratamento da leishmaniose, o ideal é que se tenha uma inibição da arginase de Leishmania, sem que se iniba a arginase I, pois isso aumentaria a concentração de amônia no organismo, sendo prejudicial à saúde do hospedeiro. O fracionamento de extratos vegetais de Caryoocar brasiliensis (CAMB), o pequi, levou ao isolamento de biomoléculas com atividade inibidora seletiva para arginase do parasita, e capazes de reduzir a taxa de crescimento em culturas de Leishmania Leishmania amazonensis.

METODOLOGIA:

O extrato de folhas de pequi foi realizado com hexano em aparelho Soxhlet a 10% m/v. A massa da droga foi utilizada em maceração com etanol:água 3:7 v/v. O extrato foi precipitado com arginina 100 mM e centrifugado a 12.000 rpm/15 minutos. O sobrenadante foi fracionado e utilizado em ensaio de inibição. O fracionamento do extrato foi realizado em coluna de 7,5 x 1,5 contendo sílica. Após equilíbrio da coluna com o solvente da maceração foram aplicados 2 mL da amostra na coluna e a eluição foi realizada com 20 mL de água. As 14 frações (1,5 mL) coletadas foram utilizadas em ensaio de inibição da enzima arginase. O ensaio de inibição pelas frações eluídas foi realizado utilizando 40% do volume de reação da fração eluída. Em seguida, realizou-se a análise da uréia produzida. Foi feito um controle negativo e positivo para a inibição. A medida da atividade da arginase foi feita pela determinação da concentração de uréia produzida pela hidrólise de L-arginina. A concentração foi determinada pelo método colorimétrico de Berthelot. Partindo de um inóculo inicial homogêneo de 106 células/mL de L. (L.) amazonensis foram administrados 1 mL da droga vegetal (frações 7 ou 8) diluída 1:1 em água em 10 mL de cultura de Leishmania. O controle foi realizado administrando-se 1 mL de água.

RESULTADOS:

Os ensaios demonstraram que nas frações 7 e 8 respectivamente, houve inibição significativa da arginase de Leishmania de 81 e 65%, e baixa inibição da arginase de rato de 11% e menos de 1%. Esta inibição seletiva da arginase de Leishmania é de fundamental importância do ponto de vista terapêutico, podendo indicar seletividade pela enzima do parasita causando baixo efeito adverso no hospedeiro. Esse foi o critério utilizado para a escolha das frações para o teste em cultura de promastigotas. Após 48 h da administração das drogas houve redução na taxa de crescimento de 50% para as culturas com a fração 7 e 22% para a fração 8, essa redução, após 72 h, declinou para 21% na fração 7 e 9% na fração 8, comparadas ao controle. Esses resultados sugerem que a droga conseguiu reduzir o crescimento das culturas. Como foi feita uma administração em dose única pode-se sugerir que por algum mecanismo de adaptação a Leishmania está metabolizando a droga, e os níveis necessários para o controle do crescimento não estão sendo mantidos, por isso no segundo dia houve um crescimento acentuado.

CONCLUSÕES:

Utilizando o fracionamento por cromatografia líquida em coluna, foi possível isolar biomoléculas capazes de inibir consideravelmente a arginase de Leishmania sem inibir a arginase de rato, ou com inibição muito baixa. E essas mesmas frações quando administradas em culturas da forma promastigota de Leishmania reduziram a taxa de crescimento do parasita de maneira significativa. A aplicação diária será testada para verificar se o parasita desenvolve resistência à droga utilizada.

Instituição de fomento: CNPQ

Trabalho de Iniciação Científica

Palavras-chave: Arginase, NOS II, Pequi

E-mail para contato: samirafarm@hotmail.com