60ª Reunião Anual da SBPC

INTRODUÇÃO:

A calreticulina é uma proteína que está associada ao equilíbrio entre parasito e hospedeiro por algumas de suas funções, tais como: inibição da ativação do sistema complemento; inibição da coagulação sanguínea; angiogênese; participação na adesão celular; participação na atividade lítica de perforinas de células T e NK. O helminto nematódeo Lagochilascaris minor produz uma molécula semelhante à calreticulina, porém de difícil purificação. Visando a obtenção de antígenos que permitam um diagnóstico específico e o entendimento da relação existente entre parasito/hospedeiro, estabelecemos um protocolo para a purificação da calreticulina de L. minor, por cromatografia de afinidade em coluna de Sepharose−Brometo de Cianogênio associada a anticorpos anti-calreticulina heterólogos.

METODOLOGIA:

O extrato bruto do parasito foi obtido segundo Freitas et al (2002). Anticorpos de coelho anti−calreticulina foram acoplados à coluna de Sepharose−Brometo de Cianogênio segundo protocolo da Rab-Lab, e a molécula calreticulina−like do parasito purificada por afinidade. A pureza da molécula obtida foi avaliada por SDS-PAGE, seguido de impregnação pela prata. A especificidade calreticulina-like foi confirmada por reação imunoenzimática e “immunoblot”, utilizando-se anticorpo de coelho anti−calreticulina e conjugado anti−coelho ligado à peroxidase, acrescentando à reação uma mistura cromógeno-substrato.

RESULTADOS:

A calreticulina do parasito apresentou-se em concentrações baixas nos extratos brutos de L. minor, representando aproximadamente 0,1% do total de proteínas do parasito. O material eluído da coluna de afinidade demonstrou corresponder à calreticulina pela reação positiva de ELISA e “dot-blot” com anticorpos anti−calreticulina. A calreticulina purificada apresentou duas bandas com massas moleculares de 60 kDa e 48kDa no SDS-PAGE. Já pelo “immunoblot” detectamos banda adicional de aproximadamente 95 kDa. Esta última pode corresponder à molécula de calreticulina associada a proteínas ribossomais do parasito.

CONCLUSÕES:

A purificação da calreticulina foi realizada eficientemente em coluna de Sepharose ativada com Brometo de Cianogênio acoplado à IgG de coelho anti-calreticulina.A molécula calreticulina-like de L. minor apresenta massa molecular aproximada de 60 kDa, com um sub-produto de 48kDa. No immunoblot, detectamos uma proteína de massa molecular aproximada de 95 kDa, que pode corresponder à molécula associada a proteínas ribossomais.

Instituição de fomento: CNPQ

Trabalho de Iniciação Científica

Palavras-chave: Calreticulina, L. minor, extrato bruto

E-mail para contato: northon_adriano@yahoo.com.br