60ª Reunião Anual da SBPC

INTRODUÇÃO:

A Síndrome de Frasier (SF) possui herança autossômica dominante e é caracterizada por mutações no gene WT1 (Wilms Tumor gene) localizado no cromossomo 11 humano. Pacientes com SF apresentam cariótipo 46,XY, genitália externa feminina normal, gônadas disgenéticas com alto risco de gonadoblastoma e glomeruloesclerose focal e segmentar sem risco aumentado de tumor de Wilms. A proteína WT1 atua como fator de transcrição do tipo dedo de zinco e possui quatro isoformas principais, produzidas através de splicings alternativos. Estes afetam o exon 5, promovendo ou não a inserção de 17 aminoácidos e, um sítio doador de splicing no final do exon 9, levando à presença ou ausência da trinca de aminoácidos lisina, treonina e serina (+KTS ou -KTS, respectivamente). A ação normal do gene depende de qual isoforma predomina, sendo que mutações que alterem sua função normal podem causar doenças do desenvolvimento gonadal associadas a problemas renais. Foram descritas mutações no sítio doador de splicing no intron 9, resultando na alteração da proporção +KTS/-KTS, com perda da isoforma +KTS. No presente trabalho, foi realizado o estudo molecular do gene WT1 em uma paciente encaminhada com quadro clínico de SF e foi encontrada a alteração IVS9+4C/T em heterozigose justificando seu fenótipo.

METODOLOGIA:

A paciente foi encaminhada pelo Grupo Interdisciplinar de Estudos da Determinação e Diferenciação do Sexo do Hospital das Clínicas (GIEDDS), Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Campinas, SP, Brasil. A extração do DNA genômico foi realizada a partir de sangue total periférico através do método fenol/clorofórmio. Os 10 exons do gene WT1 foram amplificados pela Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) a partir do DNA genômico com primers específicos para as regiões flanqueadoras de cada exon. O tamanho dos produtos de PCR foi determinado por eletroforese em gel de agarose 1% e corados utilizando-se brometo de etídeo. Os produtos de PCR foram purificados por extração de banda e posteriormente seqüenciados em duas reações separadas, utilizando-se os primers sense e antisense. As reações de seqüenciamento foram realizadas utilizando-se o kit BigDye ^TM Terminator Cycle Sequencing Kit V2.0 Ready Reaction(ABI PRISM/PE Biosystems). As leituras das reações foram realizadas utilizando-se o equipamento de leitura automática ABI PRISM 3700 (ABI PRISM/PE Biosystems). As seqüências obtidas foram analisadas e comparadas com a seqüência normal do gene.

RESULTADOS:

Uma troca C>T em heterozigose foi encontrada na posição +4 do segundo sítio doador de splicing do intron 9 (IVS9+4C/T). Existem 2 sítios para splicings alternativos no final do exon 9. O sítio 1 gera os transcritos -KTS. O sítio 2, localizado 9 nucleotídeos downstream, permite a inserção de +KTS. Mutações nesta região parecem alterar a eficiência dos splicings alternativos, resultando em um desequilíbrio na proporção 2+KTS:1-KTS normal nos tecidos. Quando ocorre a mutação em heterozigose a proporção é alterada para 1+KTS:2-KTS. O correto balanceamento desta proporção parece estar relacionado com o desenvolvimento normal do trato genitourinário. Portanto, a subexpressão da isoforma +KTS e a superexpressão da isoforma –KTS é a base para a SF. Existem evidências que sugerem que a forma -KTS esteja associada com fatores de transcrição e a forma +KTS, com fatores de splicings. Esta observação pode estar relacionada com a presença na proteína WT1 de um domínio C-terminal de 4 dedos de zinco que se ligam ao DNA e de um domínio N-terminal que se liga ao RNA. Já foram descritas mutações pontuais no segundo sítio doador de splicing no intron 9 em outras populações, no entanto esta mutação, que condiz com o fenótipo da paciente aqui descrita, é inédita na população Brasileira.

CONCLUSÕES:

A mutação IVS9+4C/T foi encontrada pela primeira vez na população Brasileira, entretanto outras mutações já foram previamente descritas nesta população. Isto demonstra que mutações associadas ao fenótipo SF são eventos esporádicos na casuística estudada. Como não ocorrem hot spots de mutações, o estudo molecular de todos os exons transcritos torna-se importante para definir a causa do quadro clínico e favorecer assim o tratamento dos pacientes com SF.

Palavras-chave: WT1, Síndrome de Frasier, splicing alternativo

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