60ª Reunião Anual da SBPC

INTRODUÇÃO:

Neutrófilos são os mais abundantes leucócitos no sangue e são as primeiras células recrutadas para o sítio de inflamação (Nathan, 2006). Recentemente, foi descrito um novo mecanismo de morte de neutrófilos, chamado NETosis, que ocorre com a liberação, para o meio extracelular, de estruturas em formas de rede (NETs), compostas, principalmente, por DNA e proteínas. Foi mostrado que as NETs não só prendem bactérias e fungos, como também proporcionam uma alta concentração de moléculas antimicrobianas (Brinkmann et al., 2004; 2007; Urban et al., 2006 a, b; Fuchs et al., 2007). A leishmaniose é uma doença causada por protozoários do gênero Leishmania e é iniciada, no hospedeiro mamífero, quando parasitas são inoculados pelo inseto vetor durante seu repasto sanguíneo. Dessa forma, uma inflamação local é iniciada com o recrutamento, em primeiro lugar, de neutrófilos (Laskay et al., 2003; Reithinger et al., 2007). Apesar do maior número de estudos sobre o papel de neutrófilos na resposta imune a Leishmania, a influência das NETs na sobrevivência destes protozoários não é conhecida. Neste trabalho, mostramos pela primeira vez que promastigotas de Leishmania amazonensis induzem abundante liberação de NETs em neutrófilos humanos e que essa rede possui atividade tóxica ao parasita.

METODOLOGIA:

Neutrófilos humanos foram isolados de buffy coat por gradiente de densidade. Todos os procedimentos foram aprovados pelo comitê de ética para estudos em humanos do Hospital Clementino Fraga Filho (UFRJ). Neutrófilos (2X106) foram incubados com ou sem 100nM PMA por 30min. Cytochalasin D (10μg/ml), Dnase-1 (100U/ml) ou ambas foram adicionadas aos neutrófilos e a cultura foi mantida por 20 minutos, seguida da adição de L amazonensis. Após 2h a 35ºC, soro fetal bovino e urina humana (10% cada) foram adicionados ao meio e as culturas foram incubadas por dois dias a 26ºC. Para quantificar DNA liberado, neutrófilos (2X106) foram incubados com os parasitas em diferentes concentrações por 1h. Após 1h, enzimas de restrição foram adicionadas por 2h e o sobrenadante foi coletado e quantificado com um kit (PicoGreen dsDNA kit). Para microscopia, neutrófilos (1x105) foram incubados com promastigotas(5x105) por 1h e depois fixados. Em microscopia eletrônica de varredura, após interação, as interações foram fixadas com 2,5% de glutaraldeído em 0,1M de tampão cacodilato, pH 7,2, pós-fixada com 1% de tetróxido de ósmio e 0,8% de ferricianida de potássio e desidratada em etanol. Depois do ponto crítico, espécimes foram metalizados com carbono e analisados em um microscópio de varredura Jeol 1530.

RESULTADOS:

Primeiro, investigamos a relação entre NETs, de neutrófilos previamente estimulados com PMA, e promastigotas de L. amazonensis. Percebemos uma presença massiva de promastigotas nas NETs, através de microscopia de fluorescência com coloração do DNA. Investigamos, então, se as NETs possuem uma atividade leishmanicida incubando neutrófilos com promastigotas. Neutrófilos ativados por PMA mataram 53% mais parasitas que os não tratados. Para distinguir atividade fagocítica da atividade microbicida exercida pelas NETs, neutrófilos ativados por PMA foram incubados com um inibidor de fagocitose, cytochalasina D, e/ou incubados com Dnase para romper as NETs. Cytochalasina aumentou a sobrevivência do parasita 3 vezes mais que o controle, indicando que a fagocitose contribui para a morte do parasita em neutrófilos ativados por PMA. A adição de DNase também aumentou a sobrevivência dos parasitas, mostrando a atividade tóxica das NETs. Investigamos a indução das NETs pela interação neutrófilo-Leishmania. Promastigotas foram capazes de induzir a formação das NETs de neutrófilos naive de maneira dose-dependente, evidenciado pela quantificação de DNA. NETs foram marcadas com anti-elastase ou anti-hisona H2A. Percebendo que promastigotas eram vistos principalmente interagindo com as NETs, analisamos essa interação por microscopia eletrônica de varredura e visualizamos NETs com promastigotas presos e, algumas, interagindo com mais de um parasita Com os resultados acima, investigamos se NETs produzidas por neutrófilos ativados pelo parasita eram tóxicas aos parasitas (sem ativação com PMA). Observamos que parasitas são capazes de induzir a liberação de NETs e que essas estruturas participam na morte dos promastigotas (Fig 6). A sobrevivência foi aumentada 30 e 60% acima do controle com tratamento com cytochalasina e Dnase. Quando a fagocitose foi inibida por Cyt D simultaneamente com o rompimento das NETs pela Dnase, a sobrevivência dos promastigotas aumento 140% acima do controle.

CONCLUSÕES:

Neste trabalho mostramos que promastigotas de Leishmania amazonensis induziram abundante liberação de NETs em neutrófilos naive e que essas redes possuem atividade citotóxica para os parasitas.

Instituição de fomento: Capes, Faperj, CNPq e PIBIC-CNPq

Trabalho de Iniciação Científica

Palavras-chave: NETs, neutrófilos, Leishmania amazonensis

E-mail para contato: andersoncbg@hotmail.com