60ª Reunião Anual da SBPC

INTRODUÇÃO:

A orizicultura está sujeita a diversos fatores que influenciam o rendimento e o custo de produção, sendo as plantas daninhas as maiores causadoras de prejuízos. O sistema de cultivo irrigado favorece o desenvolvimento de espécies aquáticas, destacando-se Sagittaria montevidensis, monocotiledônea da família Alismataceae. O método de controle mais utilizado pelos produtores é o controle químico, com a aplicação de herbicidas na cultura. A resistência a herbicidas é causada pela pressão seletiva estabelecida pela aplicação repetitiva de produtos com o mesmo princípio ativo ou mecanismo de ação, selecionando organismos resistentes. A busca por marcadores moleculares auxilia na identificação dos biótipos resistentes antes da aplicação do produto, sendo necessária a busca de outra alternativa no controle de plantas invasoras, caso seja constatado a presença de biótipo resistente. A técnica de RAPD baseia-se na amplificação aleatória de fragmentos de DNA, permitindo classificar diferentes variedades considerando o nível de similaridade genética. O presente trabalho teve como objetivo utilizar marcadores RAPD para caracterizar genótipos de S. montevidensis e estabelecer relações entre os agrupamentos formados e resistência ou suscetibilidade a herbicidas inibidores da ALS.

METODOLOGIA:

Foram analisados 23 genótipos de dois ecótipos diferentes previamente caracterizados como resistentes ou suscetíveis aos herbicidas Sírius®, Nominee® e Only®. Folhas jovens de S. montevidensis foram coletadas e maceradas com N líquido. Foram testados quatro protocolos para a extração de DNA e foram testadas cinco concentrações de DNA: 25ng, 50ng, 75ng, 100ng e 125ng por reação, para otimização da reação. Testou-se onze iniciadores: OP F1, OP F2, OP F3, OP F4, OP F5, OP F6, OP R2, OP R3, OP R4, OP R7, OP R8. Conduziram-se reações de PCR com 1 μL de DNA e PCR-MIX constituído de 2μL de dNTP, 1U de Taq DNA polimerase recombinante, 2,5μL de PCR buffer, 2,5μL de MgCl2, 5% DMSO, água ultra pura autoclavada, e 5μL de iniciadores, totalizando um volume final de 25μL. As amplificações foram realizadas em termociclador PTC-100TM (M.J. Research, Inc.), nas seguintes condições: desnaturação inicial de 1min a 94 ºC; 40 ciclos de 1min a 92ºC, 1min a 35ºC e 2min a 72ºC; e extensão final de 5min a 72ºC. Os fragmentos obtidos foram submetidos a eletroforese em gel de agarose a 1,5% em tampão TBE pH 8,4, sob voltagem constante de 70V durante 150 minutos. O gel foi corado com SYBR® Safe (Invitrogen) e visualizado sob luz ultravioleta.

RESULTADOS:

Dois protocolos possibilitaram a obtenção de DNA de boa qualidade e em concentração: Doyle & Doyle (1990) e Ferreira et al. (2004). No entanto, também apresentaram altas concentrações de ácidos nucléicos de baixo peso molecular, posterior tratamento com RNase A resultou na eliminação desses ácidos nucléicos, indicando que os mesmos se tratavam de RNA. Houve amplificação dos fragmentos nas cinco concentrações de DNA, sendo que a melhor visualização dos fragmentos ocorreu para a maior concentração de DNA (125 ng). Obteve-se boa amplificação com os iniciadores OP F1 e OP F2, observando-se 45 fragmentos, variando entre aproximadamente 490pb e 1.650pb. Houve polimorfismo entre os iniciadores testados que apontaram diferenças genéticas entre os indivíduos. O iniciador OP F1 apresentou 22 fragmentos, variando entre 550 pb a 1650 pb e o iniciador OP F2 apresentou 23 fragmentos, variando entre 490pb a 1550pb. A análise de conglomerados gerou dois grupos bem definidos, com apenas 14% de similaridade entre si, diferenciando os dois ecótipos analisados, houve alto nível de variabilidade genética entre os indivíduos de um mesmo ecótipo. Não foi possível a identificação de marcadores moleculares que indicasse resistência ou suscetibilidade dos indivíduos aos herbicidas.

CONCLUSÕES:

O melhor protocolo para obtenção de DNA de S. montevidensis é o proposto por Doyle e Doyle (1990); A concentração ideal de DNA para reações de RAPD-PCR, para esta espécie, é 125ng; Os iniciadores que forneceram maior polimorfismo entre os indivíduos são OP F1 e OP F2, sendo que o iniciador OP F1 apresentou 22 fragmentos, variando entre 550 pb a 1650 pb e o iniciador OP F2 apresentou 23 fragmentos, variando entre 490pb a 1550pb; Há alto nível de diversidade genética tanto entre os ecótipos quanto entre os indivíduos de um mesmo ecótipo; A análise de conglomerados é eficiente para separar os dois ecótipos em grupos distintos, porém não se consegue identificar um marcador específico ligado a resistência ou suscetibilidade a herbicidas nesta espécie.

Instituição de fomento: Univali (Art.170); FAPESC; EMBRAPA

Trabalho de Iniciação Científica

Palavras-chave: Sagittaria montevidensis, marcadores moleculares, resistência a herbicida

E-mail para contato: urbinati@univali.br