60ª Reunião Anual da SBPC

INTRODUÇÃO:

Os interferons (IFNs) fazem parte de uma grande família de proteínas que apresentam efeitos antiviral, antiproliferativo e imunomodulatório. O interferon-beta (IFN-β) humano é uma glicoproteína que contém 166 aminoácidos e peso molecular de 22,5 kDa. O principal uso terapêutico do IFN-β ocorre no tratamento da esclerose múltipla (EM), uma doença auto-imune que afeta o sistema nervoso central. O Ministério da Saúde distribui gratuitamente esse medicamento aos indivíduos acometidos pela EM, mas o alto custo faz com que ocorra a falta do mesmo. A produção nacional representaria a redução dos gastos com as importações e garantiria a distribuição do IFN-β a todos os indivíduos portadores da doença. O presente trabalho tem como objetivo expressar de forma transitória e permanente o IFN-β humano recombinante em células de ovário de hamster chinês (“ovary hamster chinese cells-CHO”) e avaliar a atividade biológica do IFN-β através de um ensaio in vitro.

METODOLOGIA:

O gene do IFN-β humano, previamente isolado, foi clonado no vetor plasmidial pcDNA3.1/V5-His-Topo (Invitrogen). Células competentes de Escherichia coli, cepa TOP 10, foram transformadas com o plasmídio pcDNA 3.1+IFN-β, através de choque térmico. Análise do perfil de restrição, com a endonuclease Nde I, foi conduzida para a seleção dos clones recombinantes. Linhagens celulares contínuas tipo CHO-K1 e HEK-293-T (“human embryonic kidney – T cells”) foram utilizadas para a realização de ensaios de transfecção transitória e obtenção de clones celulares secretores de IFN-β humano recombinante. Avaliações quanto à expressão do IFN-β, nas linhagens celulares mencionadas, foram conduzidas utilizando os seguintes ensaios: ELISA, Western blot e RT-PCR. Para avaliar a atividade biológica do IFN-β humano recombinante foi realizado um ensaio in vitro, no qual uma placa de 24 cavidades foi semeada com células de rim de macaco verde africano (VERO). Algumas cavidades foram tratadas com IFN-β, enquanto outras receberam apenas o meio de cultura. As células foram expostas ao vírus da encefalomiocardite murina (EMC), incubadas por 24 horas e coradas com solução de cristal violeta 0,1%.

RESULTADOS:

Após a transformação com o plasmídio pcDNA3.1+IFN-β, foram selecionados três clones para análise do perfil de restrição. Bandas de aproximadamente 1.190 pares de base (pb) foram reveladas, indicando que o gene do IFN-β foi clonado na orientação correta. Células CHO-K1 foram transfectadas com a construção pcDNA3.1+IFN-β, mas nenhuma secreção do IFN-β foi detectada em ensaios transitórios. Foram estabelecidos clones permanentes e os sobrenadantes obtidos analisados por ELISA. Os clones 4.1, 4.2 e 8.1 apresentaram resultados positivos. Em seguida, foi realizado um ensaio de RT-PCR no qual foram amplificados fragmentos de aproximadamente 473 pb, indicando a presença de moléculas de RNA mensageiro referentes ao IFN-β. Visando detectar a expressão transitória do IFN-β, células HEK-293-T foram transfectadas e os sobrenadantes obtidos analisados por ELISA. Foi possível observar altos níveis de expressão transitória nos clones 4, 7 e 8. O sobrenadante do clone 4 foi analisado em Western blot, onde foram reveladas bandas de 18 e 22 kDa, referentes ao IFN-β na forma não-glicosilada e glicosilada, respectivamente. Através do ensaio in vitro, demonstrou-se que o IFN-β humano recombinante apresenta atividade biológica, já que conferiu proteção às células VERO contra a ação do vírus EMC.

CONCLUSÕES:

Foi possível expressar de forma permanente o IFN-β humano recombinante em células CHO-K1. Apesar disso, verificou-se que essas células não representam um sistema adequado para expressão transitória do IFN-β devido ao baixo nível de expressão, considerando uma futura escala de produção. Foi possível detectar altos níveis de expressão transitória do IFN-β em células HEK-293-T, comprovando a funcionalidade da construção plasmidial utilizada bem como a aplicabilidade dessa linhagem celular. O IFN-β humano recombinante apresentou atividade biológica no ensaio in vitro, conferindo proteção contra a ação viral. Dessa forma, surgem perspectivas de que as metodologias utilizadas no presente trabalho possam ser aplicadas a um sistema de células compatível com os níveis de expressão exigidos para a produção industrial do IFN-β.

Instituição de fomento: CNPq / FIOCRUZ

Trabalho de Iniciação Científica

Palavras-chave: interferon-β, recombinante, expressão

E-mail para contato: haroldo@bio.fiocruz.br