60ª Reunião Anual da SBPC

INTRODUÇÃO:

As células-tronco mesenquimais multipotentes (CTMs) foram originalmente descritas na medula óssea (MO) de adultos na década de 60 como células-tronco distintas das células-tronco hematopoéticas em virtude de sua propriedade de originar células do tecido conjutivo como adipócitos, osteoblastos, condrócitos. Seu principal papel na medula óssea é a manutenção da hematopoese. Os pericitos foram originalmente descritos há mais de 100 anos como as células perivasculares, periendoteliais, células murais, entre outras denominações de acordo com o tecido em que estão presentes. Os pericitos emitem longas projeções citoplasmáticas em direção as células endoteliais perfazendo uma interação íntima com as mesmas. Os fibroblastos foram originalmente descritos há cerca de 150 anos e é responsável pela síntese de colágeno intersticial fibrilar, desempenhando importante papel suporte e sustentação dos tecidos em nosso organismo. Estudos posteriores mostraram que fibroblastos e pericitos também apresentavam o potencial de diferenciação em adipócito, osteócito e condrócito. Com base nesses achados, propusemos a hipótese de que células-tronco mesenquimais, pericitos e fibroblastos consistiriam tipos celulares similares e que apresentariam uma ampla distribuição no nosso organismo na parede dos vasos sangüíneos. Para investigarmos essa hipótese nos propusemos a isolar células-tronco mesenquimais de 12 tecidos adultos e fetais, fibroblastos de três tecidos e pericitos purificados ou não da retina.

METODOLOGIA:

O procedimento utilizado para o isolamento de CTMs do sangue da MO e do sangue do cordão umbilical foi a técnica clássica de cultivo das células da fração mononuclear por 48 hs em meio α-MEM/15% de SFB, seguida da remoção da células não aderentes após esse período. Para a obtenção das CTMs de 6 tecidos fetais (artéria carótida, músculo da fáscia, testículo, fígado, pulmão e timo) e 4 tecidos adultos (veia e artéria umbilical, veia safena e tecido adiposo) foi realizada a digestão do tecido com colagenase, seguida do plaqueamento das mesmas como mencionado acima. Para o isolamento dos fibroblastos foi utilizado o mesmo procedimento e o cultivo das células realizado em meio RPMI + 10% SFB. Por fim, para o isolamento de pericitos da retina utilizamos o procedimento descrito acima, seguida da purificação das mesmas por citometria de fluxo após a marcação com o anticorpo anti-CD146. Em seguida, o cultivo utilizado foi o meio α-MEM/15% de SFB. Todas as culturas foram realizadas até a terceira passagem. Após esse período as similaridades entre os diferentes tipos celulares foram investigadas utilizando 6 parâmetros distintos: 1) caracterização morfológica; 2) perfil imunofenotípico utilizando um painel de 17 anticorpos monoclonais; 3) potencial de diferenciação in vitro em adipocito, osteocito e condrocito; 4) análise por SAGE para a obtenção do transcriptoma das células perivasculares da retina; 5) RT-PCR em tempo real para 7 marcadores celulares específicos e 5) perfil de expressão gênica por RT-PCR semi-quantitativo.

RESULTADOS:

Analises morfológicas a nível de microscopia de luz e ultra-estrutura por microscopia eletrônica revelou a morfologia “fibroblastóide” similar, núcleo alongado, central e riqueza em RER e ribossomos. A análise imunofenotípica utilizando um painel de 17 anticorpos monoclonais mostrou a positividade para diferentes marcadores de superfície (CD73+, CD90+, CD29+, CD49a+, CD44+, CD54+) e a negatividade para marcadores de células endoteliais (CD31 e KDR) ou marcadores hematopoéticos (CD34 e CD45) em todas as culturas. O potencial de diferenciação em adipócitos, osteócito e condrócitos também foi observado para esses diferentes tipos celulares. Em seguida, utilizando o método de análise por SAGE foi possível demonstrar que os pericitos da reinta apresentavam perfil de expressão gênica similar às células-tronco mesenquimais da medula óssea, da parede da veia umbilical e das células estreladas hepáticas. Um perfil distinto foi observado para outras células não relacionadas (células-tronco hematopoéticas e endoteliais). Confirmações dessas similaridades foram demonstrado por análise do nível de expressão gênica por RT-PCR em tempo real para seis sete genes distintos e por RT-PCR semi-quantitativo de 39 genes em 23 tipos celulares. Apesar da similaridade, esse estudo revelou também diferenças no nível de expressão de alguns genes, que estariam relacionadas ao local onde essas células foram isoladas.

CONCLUSÕES:

Em conjunto, esse estudo mostra evidências de que as células-tronco mesenquimais e pericitos são células similares presentes na parede sub-endotelial dos vasos sangüineos onde funcionariam como fontes de células de reparo e manutenção de vários tecidos.

Instituição de fomento: FAPESP; CNPq e FINEP

Palavras-chave: Células-tronco mesenquimais, pericitos, fibroblastos

E-mail para contato: fontesam@hemocentro.fmrp.usp.br