60ª Reunião Anual da SBPC

INTRODUÇÃO:

O teste do cometa é um método de análise de lesões no DNA amplamente utilizado para quantificar seus danos oxidativos e crosslinks, apoptose e a genotoxicidade de substâncias químicas como produtos químicos, farmacêuticos, agroquímicos, entre outros. A técnica é sensível para detectar lesões em fita simples de DNA, lesões de sítios alcalinos lábeis e locais de reparos incompletos e se baseia na migração de fragmentos de DNA em microeletroforese diretamente para o ânodo formando uma “cauda”, e a imagem resultante tem a aparência de um cometa. As lâminas podem ser coradas com corantes fluorescentes ou ainda pela prata, tendo diferenças no tipo de microscópio utilizado para a análise, pela possibilidade de armazenamento das lâminas, e sendo a primeira um método com maiores dificuldades de realização. A análise das imagens pode ser realizada de maneira visual, porém, há desvantagem da subjetividade dos resultados, o que pode ser minimizado por um método automatizado de análise de imagem digital. Esse processo é estudado neste trabalho com objetivo de realizar a validação da análise de imagem digital do teste do cometa, empregando software gratuito, e propondo um método quantitativo com maior reprodutibilidade, minimizando a variabilidade e imprecisão decorrentes da análise subjetiva.

METODOLOGIA:

Utilizou-se 15 ratos Wistar machos com 8 semanas, que receberam MNU (N-nitroso-N-methylurea) na concentração de 50mg/Kg intraperitoneal, e coletado sangue periorbital para a realização do teste do cometa alcalino segundo o protocolo de Singh et al (1988) com modificações. Após preparar as lâminas e corar com prata, foram selecionados 50 cometas que foram documentados fotograficamente, somando 10 unidades para cada classe visual conforme o comprimento da cauda. Para o registro de modo padronizado das imagens, foi empregada câmera fotográfica digital Olympus Camedia C-7070 acoplada a microscópio Olympus BX41. Essas imagens foram impressas e avaliadas por três analisadores que mediram os cometas quanto ao comprimento total (mm), comprimento da cabeça (mm) e comprimento da cauda (mm) e também estimaram a classe (0 a 4). Posteriormente, as imagens foram pré-processadas a partir de algoritmos (software ImageJ) para análise automatizada e também para análise manual após o processamento digital. Os desempenhos das medidas manuais entre os avaliadores antes e após o processamento foram comparados pelo coeficiente de correlação intraclasse e a sua concordância pelo teste de Friedman, e as medidas automatizadas foram comparadas com as medidas manuais pelo teste de correlação de Spearman.

RESULTADOS:

Considerando as medidas das imagens impressas dos cometas não-processados, houve alta correlação nas estimativas do comprimento total, da cauda e das classificações visuais dos cometas entre os 3 avaliadores (p<0,05), com destaque às classificações extremas (0 e 4). Porém, em todos os parâmetros avaliados, apesar de boa correlação, as estimativas dos três avaliadores divergem entre si, não apresentando boa concordância (reprodutibilidade) (p<0,05). Para as medidas das imagens processadas digitalmente, em todos os parâmetros avaliados houve um aumento na correlação entre os avaliadores, apresentando, portanto, uma maior concordância que as medidas das imagens não-processadas. Quando comparamos os coeficientes de variação das medidas manuais das imagens não-processadas com as imagens processadas pelo método proposto, observamos um aumento da precisão na maioria das medidas, melhorando a reprodutibilidade das análises. Posteriormente, a partir de outro algoritmo, foram realizadas medidas automatizadas das imagens processadas, observando-se alta correlação (R Spearman>0,8) com as medidas manuais após o processamento, principalmente na comparação do momento da cauda com classificação visual (p<0,01), e entre os comprimentos totais (p<0,01) ou os comprimentos das caudas (p<0,01).

CONCLUSÕES:

Há certa variabilidade nas estimativas manuais dos parâmetros do cometa, e o pré-processamento da imagem melhora a correlação entre os avaliadores, aumentando a reprodutibilidade dos resultados. As medidas automatizadas pelo algoritmo desenvolvido demonstraram alta correlação com os parâmetros medidos manualmente após o processamento das imagens, com a vantagem de reduzir a subjetividade da análise feita pelos avaliadores, o que sugere seu emprego em pesquisas que utilizem o teste do cometa corado pela prata. Os algoritmos empregados são de código aberto, e somente devem ser aplicados para o teste do cometa corado com a prata e para as imagens fotografadas com o mesmo protocolo descrito.

Instituição de fomento: Fapesp - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo. IC: 07/56371-6

Trabalho de Iniciação Científica

Palavras-chave: Teste do cometa, Análise de imagem, Métodos quantitativos

E-mail para contato: gabrielli.brianezi@hotmail.com