60ª Reunião Anual da SBPC

INTRODUÇÃO:

O fungo basidiomiceto Moniliophthora perniciosa é o agente etiológico da vassoura de bruxa, principal doença que ataca o cacaueiro. Este fungo possui ciclo de vida hemibiotrófico, ou seja, apresenta um estágio biotrófico em que infecta os tecidos vivos, e um estágio saprotrófico em que infecta os tecidos mortos. O seu aparecimento no sul da Bahia, em 1989, foi responsável por um grande abalo socioeconômico neste estado, causando prejuízos para o Brasil e, apesar da intensa busca por soluções para o problema, ainda não há medidas eficazes de combate à doença. A inspeção do genoma de M. perniciosa levou à identificação de quatro genes que codificam proteínas pertencentes à família PR-1 (Pathogenesis Related Protein-1), denominados MpPR-1a a MpPR-1d. Inicialmente identificados em plantas, genes PR-1 são considerados parte dos mecanismos de defesa contra fitopatógenos, incluindo fungos e oomicetos. Uma vez que testes com microorganismos para controle biológico de M. perniciosa não apresentam resultados satisfatórios pode-se especular um possível papel de genes MpPR-1 na inibição de microorganismos competidores. Este trabalho visa à análise da expressão de genes pertencentes à família PR-1 encontrados em M. perniciosa e clonagem dos mesmos para superexpressão e ensaios de atividade protéica.

METODOLOGIA:

A análise de expressão do gene MpPR-1a durante a fase saprotrófica do fungo foi realizada por meio da técnica Northern Blot. Os experimentos consistiram em verificar a influência da adição ao meio de cultura de diferentes fontes de carbono (glicose, glicerol ou extrato de cacau), nitrogênio (BSA) ou substâncias relacionadas à sinalização e ativação de mecanismos de defesa de plantas (ácido salicílico e peróxido de hidrogênio) na expressão de MpPR-1a. Além disso, experimentos de Real Time PCR estão sendo realizados para verificar o padrão de expressão dos quatro genes MpPR-1 em diferentes fases do ciclo de vida de M. perniciosa. Para isso, foram extraídos RNAs do fungo nos seguintes estágios de desenvolvimento: primórdio de basidiocarpos, basidiocarpos, micélios das fases biotrófica e saprotrófica, micélios de fungos saprotróficos novo e senescente. Em paralelo, a região codante dos genes MpPR-1a e MpPR-1b foram clonadas nos vetores de superexpressão protéica pPROEX, pGEX4T1 e Pet28a, que foram então utilizados para transformação de cepas de Escherichia coli BL21.

RESULTADOS:

Através dos experimentos de Northern Blot observou-se que apenas a utilização de extrato de cacau como fonte de carbono induziu de maneira significativa a expressão do gene MpPR-1a. A substituição da fonte de nitrogênio (NaNO₃ 0,06%) pela proteína BSA (1%) resultou em leve indução gênica. Uma vez que a única fonte de nitrogênio neste experimento foi uma proteína, se esperaria uma indução na expressão de proteases para obtenção de nitrogênio. Isso pode indicar que MpPR1-a possa ter função proteolítica, como descrito para outras PR-1. A adição de peróxido de hidrogênio em uma concentração de 5mM resultou em indução da expressão de MpPR-1a. Além disso, a adição de ácido salicílico em concentrações de 1mM e 2mM também induziu de maneira significativa a expressão deste gene. Estes resultados demonstram que os mesmos compostos envolvidos na indução de genes PR-1 de plantas também induzem a expressão do gene MpPR-1a, sugerindo regulação similar e talvez funções em comum.

CONCLUSÕES:

Levando-se em conta que genes PR-1 de plantas possuem a função de inibir fungos e oomicetos, o fato de M. perniciosa, um fitopatógeno, apresentar estes genes em seu genoma é bastante curioso. Uma vez que oomicetos do gênero Phytophthora constituem um dos grupos que mais causam prejuízos nas culturas de cacaueiro, a existência de genes PR-1 em M. perniciosa poderia ser útil para minimizar possíveis competições com estes oomicetos durante a infecção. O fato do gene MpPR-1a ter expressão induzida por ácido salicílico e peróxido de hidrogênio é bastante interessante pois estes compostos são indispensáveis para ativação dos mecanismos de defesa de plantas e são indutores da expressão dos genes PR-1 vegetais. Os ensaios de atividade com as proteínas MpPR-1 purificadas poderão comprovar a possível função das MpPR-1 na inibição de outros microorganismos e auxiliar a desenvolver novas estratégias para o controle da doença. Além disso, as análises de expressão dos quatro genes MpPR-1 nas diferentes fases do ciclo de vida do fungo poderão fornecer dados interessante a respeito de um possível papel destes genes no desenvolvimento e patogenicidade do fungo.

Instituição de fomento: Fapesp e CNPq

Trabalho de Iniciação Científica

Palavras-chave: Moniliophtora perniciosa, interação planta-fungo, genes PR-1

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