60ª Reunião Anual da SBPC

INTRODUÇÃO:

Diversas enzimas apresentam aplicações biotecnológicas, biomédicas, farmacêuticas e industriais, podendo ser utilizadas como biossensores, biorreatores, agentes terapêuticos, e como ferramenta para em diagnósticos. Entre os principais problemas em se utilizar enzimas temos: dificuldade de sua separação do produto final, grande facilidade em se desnaturar e inativação pelo pH, temperatura e solventes orgânicos. Para minimizar tais problemas, propõe-se a utilização de enzimas imobilizadas em diversos suportes. A imobilização de enzimas é, por definição, uma técnica que confina ou liga uma enzima numa determinada região do espaço, com retenção de suas atividades catalíticas.

METODOLOGIA:

Para preparação do extrato enzimático os crustáceos foram homogeneizados em tampão. Após centrifugação, o sobrenadante foi submetido a fracionamento em três etapas de saturação com sulfato de amônio. A fração precipitada entre 0-30 % foi submetida a cromatografia de gel filtração. O perfil de eluição protéica das frações da coluna foi determinado por absorção a 280 nm. Para a determinação das atividades enzimáticas, alíquotas destas frações foram ensaiadas a com p-nitrofenil -D-N-acetilglucosaminídeo. As frações que apresentaram maior atividade β-N-acetilglucosaminidásica foi reunidas em pool e utilizadas para os experimentos de imobilização Para síntese do dacron magnetizado, as folhas do dacron foram cortadas em pequenos pedaços e foi adicionado hidrato de hidrazina sob agitação para que este se transforme em pó. O suporte magnético foi ativado com glutaraldeído . Em seguida, a sulfatase foi adicionada a 10 mg do suporte ativado. Após isso o sobrenadante foi removido e foram realizadas dez lavagens com tampão acetato de sódio de cada um dos tubos. Logo após foi adcionado glicina para bloquear os sítios ainda livres do glutaraldeído. Além disso foi determinada da influência de íons sobre a atividade catalítica da β-N-acetilglucosaminidase imobilizada.

RESULTADOS:

O pH ótimo encontrado para a enzima imobilizada foi de 5,5, observando-se atividade também nos pH 6,5 e 7,5 demonstrando assim uma β-N-glucosaminidase de ampla faixa de pH para ação enzimática. A N-acetil- solúvel mostrou maior atividade no pH 6,5, já no pH 7,5 perdeu mais de 90% desta. A enzima imobilizada apresentou temperatura ótima de 50°C, embora nas temperaturas de 45°C e 60°C apresenta em torno de 80% de sua -D-glucosaminidase solúvel teve melhoratividade máxima. A N-acetil- atividade a 60°C, já a 70°C perdeu 95% de sua atividade. O efeito do tempo sobre a atividade da enzima imobilizada mostrou que, após os trinta minutos iniciais de ensaio ocorreu diminuição na velocidade da reação. Para a enzima solúvel foi observado que após 3 horas houve pouca alteração na velocidade, tendendo a estabilidade, demonstrando ótima estabilidade. Os sais KCL, MgCl2, CaCl2 e MnCl2 potencializaram a atividade da enzima imobilizada, já a solúvel foi potencializada apenas pelo MnCl2. O AgNO3 inibiu a atividade de ambas. A -D-glucosaminidase pôde ser utilizada por 10 vezes comN-acetil- retenção de 100% de sua atividade inicial.

CONCLUSÕES:

Os resultados obtidos nesse trabalho serviram para caracterizar e comparar alguns parâmetros cinéticos da enzima -D-glucosaminidase imobilizada à solúvel. A enzima β-N-acetil- imobilizada demonstrou maior estabilidade frente a pH, temperatura e melhor atividade na presença de alguns sais inorgânicos (KCL, MgCl2, CaCl2 e MnCl2). Ambas foram inibidas pelo AgNO3. A enzima imobilizada pode ser utilizada 10 vezes sem perda de atividade, possibilitando uma redução de custos na sua aplicação, uma vez que pode ser reutilizada. Conhecendo-se melhor os parâmetros que afetam a atividade da enzima, podemos propor sua potencial aplicação e utilização como ferramenta biotecnológica.

Instituição de fomento: CNPq, CAPES e UFRN

Trabalho de Iniciação Científica

Palavras-chave: Imobilização, glucosaminidase, biotecnologia

E-mail para contato: neripereira_bioufrn@hotmail.com