60ª Reunião Anual da SBPC

INTRODUÇÃO:

O fungo basidiomiceto M. perniciosa é o patógeno causador da doença vassoura-de-bruxa em Theobroma cacao e, desde o seu aparecimento na região sul da Bahia, tem representado um importante obstáculo para a viabilidade econômica da cultura cacaueira no Brasil. Os sintomas da doença compreendem perda da dominância apical, clorose e hipertrofia e hiperplasia dos tecidos infectados, resultando no enfraquecimento da planta e diminuição na sua produção. Muitos fungicidas empregados em lavouras, como as drogas a base de estrobilurinas, se baseiam na inibição de complexos específicos da cadeia de transporte de elétrons mitocondriais (CTE). M. perniciosa mostrou-se insensível a estrobilurina em campo, mas a substância inibiu do crescimento do fungo em testes em laboratório. Especula-se que alterações no metabolismo energético do fungo ao longo de seu desenvolvimento causem as diferenças observadas. A resistência ao fungicida seria explicada pela atividade de uma oxidase alternativa, cujo gene foi encontrado no genoma do fungo. Assim, visando entender o metabolismo energético do fungo ao longo do seu desenvolvimento, estabeleceu-se metodologia para propiciar análises bioquímicas dos componentes da CTE do patógeno, pois estes componentes podem ser alvos em potencial no combate à doença.

METODOLOGIA:

Três abordagens foram testadas para a futura caracterização da cadeia respiratória do fungo. A primeira abordagem utilizou hifas intactas, a segunda protoplastos isolados e a terceira baseou-se no isolamento de mitocôndrias. A eficiência de cada técnica foi verificada por meio da análise do consumo de oxigênio determinado polarograficamente com eletrodo tipo Clarck (Yellow Springs Instruments Co.), ligado a um oxígrafo Gilson (Gilson Medical Eletronics Inc., Middleton, WI). As variações nas taxas de consumo de oxigênio perante a adição de substratos e inibidores específicos de componentes da cadeia respiratória principal e das vias alternativas foram utilizadas para avaliar a credibilidade das metodologias testadas. Assim, cada técnica empregada foi avaliada quanto à permeabilidade aos substratos, inibidores e estimuladores do consumo de oxigênio e verificou-se, quando possível, o acoplamento mitocondrial. A dificuldade em se obter o preparado final e a reprodutibilidade da metodologia também foram critérios para a escolha da técnica.

RESULTADOS:

Os testes iniciais com hifas intactas do fungo geraram respostas pouco confiáveis após a exposição do material aos inibidores de componentes da cadeia de transporte de elétrons (CTE). Testes seguintes foram feitos em protoplastos do fungo, obtidos por ação enzimática. O tempo ideal de ação da enzima sobre o material e o osmolito adequado para manutenção das células foram ajustados visando o aumento da eficiência da protoplastização. O preparado final apresentou curvas de consumo de oxigênio reprodutíveis, mas insensíveis a alguns estimuladores e inibidores. Também não foi possível comprovar se as taxas de consumo de oxigênio eram estritamente mitocondriais ou decorrentes da atuação de outros componentes celulares, como os peroxissomos. Finalmente, o isolamento de mitocôndrias do fungo gerou resultados confiáveis e criteriosos da CTE do fungo, de modo que a metodologia estabelecida será empregada em estudos futuros para caracterização da CTE de M. perniciosa.

CONCLUSÕES:

A utilização de hifas íntegras nos ensaios de consumo de oxigênio não foi adequada, visto que a metodologia não gerou resultados confiáveis. A utilização de protoplastos para a caracterização da cadeia respiratória do fungo M. perniciosa mostra-se bastante eficiente quando se analisa a via alternativa e os complexos III e IV, mas ensaios envolvendo substâncias como malato, glutamato, succinato, oligomicina e CCCP, não são conclusivos. O extrato mitocondrial atendeu aos principais critérios de qualidade utilizados em análises bioquímicas de cadeias respiratórias, como presença de linha de base, razão ADP:O, controle respiratório e formação de potencial de membrana. Entretanto, ainda há a necessidade da determinação de inibidores e estimuladores ideais e suas concentrações, para se conduzir análises criteriosas dos componentes da cadeia transportadora de elétrons de M. perniciosa.

Instituição de fomento: FAPESP - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo

Trabalho de Iniciação Científica

Palavras-chave: Mitocôndria, Moniliophthora perniciosa, Cadeia de transporte de elétrons

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