60ª Reunião Anual da SBPC

INTRODUÇÃO:

Os hormônios tireoidianos são fundamentais para a proliferação e diferenciação celular de vários tecidos, incluindo o tecido ósseo (Nunes, 2003). A triiodotironina (T3), hormônio metabolicamente ativo aumenta a síntese de matriz óssea por aumentar a atividade do osteoblasto (Serakides et al., 2004), célula que deriva da diferenciação das células tronco mesenquimais (CTM) da medula óssea (Huang et al., 2007). Pelo fato das pesquisas in vivo demonstrarem que o tecido ósseo de ratas com osteoporose tratadas com tiroxina apresenta focos de hiperplasia de osteoblastos (Serakides et al., 2004), postulou-se que os hormônios tireoidianos sejam importantes para a diferenciação osteogênica das CTM. Assim, o objetivo deste estudo foi verificar o efeito in vitro de várias doses da triiodotironina na diferenciação osteogênica das CTM extraídas da medula óssea de ratas e cultivada ao longo de vários períodos. A importância de se estudar o efeito da T3 na diferenciação osteogênica das células tronco recai sobre a possibilidade de incrementar o processo de diferenciação in vitro, trazendo benefícios quando da utilização dessas células in vivo para o tratamento de doenças ou defeitos ósseos.

METODOLOGIA:

Utilizaram-se fêmur e tíbia de ratas Wistar para extração das CTM da medula óssea, cultivadas em DMEM enriquecido e soro fetal bovino a 37^oC e 5% de CO₂. Após quatro repiques, 1x10⁵ CTM foram cultivadas em triplicata em DMEM enriquecido acrescido de ácido ascórbico, β-glicerofosfato e dexametasona por 7, 14 e 21 dias com T3 (doses de 10^-3nM, 10^-2nM, 1nM e 100 nM) e sem T3 (controle). A caracterização fenotipica das células foi realizada antes da diferenciação osteogênica por citômetro de fluxo FACScan (Fluorescence Activated Cell Analyser) empregando o software Cell Quest. Os anticorpos primários utilizados foram: anti-CD45, anti-CD90, anti-CD73 e anti-CD54. Durante a diferenciação osteogênica, foi avaliada a atividade da fosfatase alcalina pelo ensaio BCIP-NBT e a capacidade de conversão do MTT em cristais de formazan, ambos por espectrofotometria (595nm). O colágeno foi corado pelo sirius red, dosado em espectrofotômetro (540nm) e avaliado em microscopia de campo escuro sob luz polarizada. Nódulos de mineralização foram corados pelo Von Kossa para avaliação do número de nódulos/campo e do diâmetro médio dos nódulos. Para cada variável estudada foram determinados a média e o desvio padrão. Foi realizada ANOVA e as médias foram comparadas pelo teste de Student-Newman-Keuls (SNK).

RESULTADOS:

Antes da diferenciação osteogênica, as células apresentaram ausência de CD45 (96,94%) e expressão de CD73 (93,99%), CD54 (95,10%) e CD90 (86,77%), as duas ultimas exclusivas das CTM, não sendo expressas em fibroblastos e células hematopoéticas. A dose de 100nM apresentou efeito negativo na diferenciação osteogênica de CTM, com menor síntese de colágeno em comparação ao controle com formação de inúmeros cristais de fosfato de cálcio. A dose de 10^-2 nM de T3 além de estimular a síntese de colágeno, também promoveu melhor maturidade desse colágeno. No entanto, a dose de 10^-3nM de T3, apesar de resultar em síntese de colágeno semelhante à dose de 10^-2nM de T3, demonstrou maturação do colágeno inferior. Os cultivos com 10^-2nM de T3 apresentaram menor densidade celular em todos os períodos estudados. Sugere-se que essa redução esteja relacionada à redução da proliferação celular e não a redução da viabilidade celular, já que a conversão do MTT foi maior neste grupo. Além disso, é provável que a T3 na dose de 10^-2nM tenha estimulado a atividade de síntese em detrimento da proliferação celular, já que houve neste grupo maior atividade da fosfatase alcalina, maior síntese e maturação do colágeno e maior mineralização da matriz em comparação a todos os demais grupos.

CONCLUSÕES:

A triiodotironina apresenta efeitos dose dependente sobre a diferenciação osteogênica de CTM da medula óssea de ratas: 1) A dose de 10^-2nM de T3 promove melhor diferenciação osteogênica, caracterizada por maior conversão do MTT em cristais de formazan, síntese precoce de fosfatase alcalina, maior síntese e maturação de colágeno e maior número e diâmetro médio dos nódulos de mineralização. 2) A dose de 10^-3nM de T3 estimula precocemente a atividade da fosfatase alcalina, aumenta o número dos nódulos de mineralização e a síntese de matriz colagênica, mas reduz a maturidade do colágeno. 3) A dose de 100nM de T3 demonstra efeito negativo sobre a diferenciação osteogênica por reduzir a síntese de colágeno e por promover a formação de incontáveis cristais a partir dos 15 dias de cultivo.

Instituição de fomento: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq/Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais – FAPEMIG

Trabalho de Iniciação Científica

Palavras-chave: triiodotironina, célula tronco mesenquimal, diferenciação osteogênica

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