60ª Reunião Anual da SBPC

INTRODUÇÃO:

As arboviroses são problemas de saúde pública com incidência elevada no Brasil, em especial na Amazônia brasileira, onde o manejo inadequado dos ecossistemas contribui para a emergência e reemergência de arbovírus. Quase 200 diferentes tipos foram isolados na Amazônia. Desses 32 já foram associados com doença humana, e os vírus Dengue, Febre amarela, Oropouche e Mayaro causam epidemias, além de considerável morbidade e impacto econômico e social. O vírus Piry pertence à família Rhabdoviridae (gênero Vesiculovirus), grupo VSV e pode causar doença em humanos caracterizada por um quadro febril agudo. A prevalência de anticorpos em humanos é de 4-17% em diferentes populações. Os rhabdovírus produzem encefalite em camundongos, e membros do gênero Vesiculovirus têm sido usados como modelo de estudos in vitro e in vivo sobre a resposta adaptativa viral e a resposta imune do hospedeiro. O estudo do vírus Piry tenta compreender os efeitos da infecção viral sobre o SNC e sua correlação com uma doença neurodegenerativa de base, simulada experimentalmente pela partícula prion. Portanto, os objetivos deste trabalho são: Identificar a seqüência da neuroinfecção promovida pelo vírus Piry; Avaliar a ocorrência de infecção crônica; Investigar a correlação entre os sinais clínicos nos animais e a intensidade da imunomarcação viral no SNC; Identificar qualitativamente a presença de proliferação astrocitária por imunoistoquímica anti-GFAP.

METODOLOGIA:

Foram usados 120 camundongos Mus Musculus fêmeas (idade: 12 semanas), divididos em dois grupos (controle n=50; infectado n=70). O inóculo (diluição: 10^-7) foi obtido por macerado de cérebros de camundongos neonatos infectados com o vírus Piry. Setenta animais receberam, por via intranasal, 20 microlitros (10 microlitros em cada narina) de suspensão viral. Cinqüenta animais receberam suspensão de cérebro não infectado. Nos tempos de sobrevida de 1, 2, 4, 6, 8, 12, 15, 30, 60 e 90 dias, 5 animais infectados e 5 controles foram anestesiados com avertina, via intra-peritonial, e perfundidos por via intra-cardíaca com solução salina 0,9% e paraformaldeído 4%. Os cérebros foram seccionados em plano axial a 70µm em vibrátomo (Micron®, HM 650V). A imunoistoquímica anti-Piry foi feita em tecidos de todos os animais, empregando anticorpo primário policlonal anti-Piry e o kit VECTOR® M.O.M. As secções foram incubadas no anticorpo primário (1:30, v/v) por 72 horas, no secundário à 1:300 por 12 horas e reveladas por GND (Níquel/DAB/Glucose oxidase), e montadas em lâminas gelatinizadas, desidratadas e recobertas por Enthelan® e lamínula. A imunoistoquímica anti GFAP foi feita em três animais infectados e dois controles, utilizando anticorpo primário anti-GFAP policlonal (Dako®, 1:300 v/v), anticorpo secundário Anti-IgG de coelho conjugado à peroxidase (Sigma®) e revelador DAB. A análise e as fotomicrografias foram feitas em microscópio Zeiss acoplado a uma câmera digital (AxioCam HRc, Zeiss).

RESULTADOS:

Sinais clínicos foram observados em 10% dos animais infectados, e que foram progressivos: hiporexia, astenia, paresia de membros inferiores, rigidez de coluna e nuca, decúbito lateral obrigatório e morte. Esse quadro ocorreu entre 3 e 15 dias pós-inoculação (dpi) e foi mais freqüente entre 6 e 8 dpi. Foi observada marcação de antígenos virais a partir de 2 dpi em pequenos focos de corpos celulares na meninge e bulbo olfatório. Progredindo, no 4º dpi, para marcação intensa em grande número de células, de forma assimétrica, no bulbo olfatório, septum, córtex, hipocampo, áreas periventriculares, fibras interventriculares e alguns vasos sangüíneos. Houve redução da marcação no 6º dpi e ausência da mesma a partir do 8º dpi. As áreas marcadas têm relação estreita com a via olfatória, sugerindo que esta rota é uma via importante na neuroinvasão para este vírus. A marcação em plexo coróide, vasos sanguíneos e a tumefação endotelial indicam possível participação da via hematogênica na entrada ou disseminação do vírus. Foi encontrada marcação mais intensa e em maior número de astrócitos em secções de cérebros infectados em todos os tempos de sobrevida analisados, quando comparados aos animais controle. Observou-se maior marcação para GFAP de 4 a 15 dpi, no bulbo olfatório, hipocampo, córtex intorrinal e parietal, septum e áreas peri-ventriculares. Essas áreas, além de estreita relação com a via olfatória, coincidem em sua maioria com aquelas mais atingidas pelo vírus Piry.

CONCLUSÕES:

Foi confirmado o neurotropismo do vírus Piry e seu padrão de marcação imunoistoquímica em vasos, hipocampo e distintas regiões cerebrais. Sendo observado um claro avanço da infecção a partir do bulbo olfatório, comprometendo outras áreas gradualmente. Porém não foi possível detectar relação direta da presença de antígenos virais por imunoistoquímica em áreas específicas com os sinais clínicos apresentados pelos animais, principalmente os do tipo motor. Não está excluída, entretanto, a hipótese de imunomarcação no corno anterior da medula espinhal, região que não foi contemplada por esta investigação. Conforme o esperado, houve gliose reativa do hospedeiro após a infecção viral e os achados da imunoistoquímica anti-GFAP colaboram para a hipótese de que a resposta do hospedeiro no SNC pode estar contribuindo para o agravamento do quadro clínico do animal. Porém destaca-se a necessidade de, no futuro, quantificar a astrocitose observada a fim de avaliar sua significância estatística, por contagem de células. Outros estudos envolvendo a resposta inflamatória no curso da infecção viral podem ser úteis para uma melhor compreensão do papel do hospedeiro na resposta aos vírus.

Instituição de fomento: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq

Trabalho de Iniciação Científica

Palavras-chave: Vírus Piry, Rhabdoviridae, Sistema Nervoso Central

E-mail para contato: zairesantos@iec.pa.gov.br