C. Ciências Biológicas - 8. Genética - 3. Genética Humana e Médica
ANÁLISE ESTRUTURAL DA PROTEÍNA EFHC1, RELACIONADA À EPILEPSIA MIOCLÔNICA JUVENIL
Andre Henrique Zamboni1
Tatiane Marques1
Marcelo J. Murai1
Ricardo Aparício2
Iscia Lopes-Cendes3
1. Faculdade de Ciências Medicas – FCM, UNICAMP
2. Instituto de Química - IQ, UNICAMP
3. Faculdade de Ciências Medicas – FCM, UNICAMP - Orientador
INTRODUÇÃO:A Epilepsia Mioclônica Juvenil (EMJ) representa 7% a 9% de todas as epilepsias. A região 6p12-p11 do cromossomo 6 humano foi identificada como responsável pela doença. Análises de interação da proteína EFHC1 com canais de cálcio voltagem-dependente revelaram que a primeira aumenta o influxo de cálcio pelo canal, acarretando, dessa forma, morte celular programada. O objetivo do trabalho é clonar o gene EFHC1 com a cauda de fusão SUMO, expressar e purificar a porção C-terminal da proteína EFHC1, para posterior análise estrutural da mesma.METODOLOGIA:Amplificação de gene por PCR, com posterior purificação e clonagem em vetor pETSUMO (Invitrogen). Verificação de clones positivos por digestão enzimática. Transformação em cepa BL21 (DE3) com plasmídio pRARE. Utilização de cromatografia de afinidade com resina Ni-NTA (Qiagen) e clivagem da cauda de fusão com protease SUMO 1.RESULTADOS:Amplificou-se o gene por PCR, a partir de cDNA total de hipocampo humano. Os produtos foram purificados e clonados em vetor pETSUMO (Invitrogen). Verificou-se a presença de clones positivos por digestão enzimática. Dois clones foram selecionados para os testes de expressão. Transformou-se a cepa BL21(DE3) juntamente com o plasmídio pRARE. Obteve-se proteína solúvel e pura utilizando-se cromatografia de afinidade através da resina Ni-NTA (Qiagen). Nos testes de clivagem com a protease SUMO 1, a eficiência da reação foi próxima de 95%, e a proteína não precipitou após a separação da cauda solubilizadora. Para separação da cauda SUMO, passou-se a reação por uma segunda coluna de afinidade (Ni-NTA), obtendo-se pureza superior a 95%.CONCLUSÕES:O processo demonstrou-se satisfatório na obtenção dessa porção da proteína. Com esse sucesso no processo, será possível realizar estudos estruturais, como caracterização do estado conformacional através de técnicas espectroscópicas como DLS e CD, além de SAXS, afim de se construir um modelo de baixa. Adicionalmente, testes cristalográficos serão realizados com essa porção da proteína. Também estão em andamento testes de clonagem, expressão e purificação de construções contendo o N-terminal da EFHC1.
Instituição de fomento: FAPESP
Trabalho de Iniciação Científica
Palavras-chave: EMJ, EFHC1, Caracterização protéica
E-mail para contato: dezamboni@yahoo.com.br
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