60ª Reunião Anual da SBPC

INTRODUÇÃO:

A Terapia Fotodinâmica (TFD) é uma modalidade médica baseada na interação de um fotossensitizador (PS) e luz no tratamento de doenças caracterizadas pelo crescimento celular anormal, como o câncer, infestações bacterianas. Uma reação entre o PS excitado e o oxigênio molecular, gera o oxigênio singlete (¹O₂), espécie reativa que necrosa tecidos doentes. As porfirinas são compostos de interesse a TFD por apresentarem características favoráveis, como alta absorção no vermelho, e grande hidrofobicidade, sendo esta responsável pelo aumento da interação de compostos com a membrana celular. Entretanto esses apresentam tendência à auto-agregação, efeito este desfavorável a TFD pela diminuição da formação de ¹O₂. As clorofilas (Chl – clorofila a, Phe – feofitina, ZnChl – Clorofila de Zn e CuChl – clorofila de Cu) podem ser estabilizadas na forma monomérica em meio aquoso utilizando surfactantes, destacando-se os neutros, como, Tween 80 (T-80) e Pluronics por serem biocompatíveis. Uma alternativa interessante para a TFD é o uso da ação foto-tóxica dos PS sobre micro-organismos (MO) tais como bactérias S.aureus, E.coli e fungos como C.albicans. Assim, formulados de clorofilas em surfactantes neutros foram estudados in vitro (MO e Artemia salina).

METODOLOGIA:

A Artemia foi eclodida em água salina (NaCl 3,8 g L^-1), sob iluminação, após 48 h foi transferida para tubos contendo Chl e Phe em T-80, e ZnChl e CuChl em P-123, completou-se o volume a 3mL com água salina, obtendo amostras com 1, 5, 10 e 50 µg mL^-1 de PS. Um grupo foi submetido à iluminação com LED por 1 h e outro sem, realizou-se a contagem após 2h. Nos testes com MO transferiu-se 1 colônia para o tubo com CMH, incubado por 15h a 37ºC (Estufa Fanem, Orion 502). Calibrou-se o inóculo suspendido com SF a 580 nm em %T de 25-30%, da suspensão realizou-se diluições em surfactantes, obtendo-se a concentração de 108 UFC mL^-1; ao inóculo calibrado, adicionaram-se PS em tensoativos. A iluminação foi realizada sobre placas em mesa (Tecnal, TE-424) a 80 rpm e 25ºC, por 30 min. Transferiu-se o conteúdo para tubos, completando-se a 4mL com CMH e mediu-se a %T. As amostras foram incubadas a 37ºC e a %T medida após tempos fixos. Adicionalmente, transferiu-se 100 µL do conteúdo da placa e dos controles para um eppendorff, a seguir, realizou-se uma diluição 1:100 e 50 µL da diluição foi cultivada em placa, incubada a 37ºC por 24 h. Realizou-se ensaios e controles em triplicata. Para os testes de fotobranqueamento e AU iluminou-se as amostras, registrando-se o espectro a tempos fixos.

RESULTADOS:

Os compostos apresentam alta absorção de luz na banda Q, com boa sobreposição aos espectros de emissão do LED, fonte utilizada nos ensaios biológicos; a sobreposição foi maior para Chl e ZnChl. As clorofilas apresentaram-se tóxicas para a Artemia mesmo sem a incidência de radiação, de maneira que a toxicidade aumenta com a concentração. Com a aplicação de luz, potencializou-se a mortalidade dos microcrustáceos. Os ensaios realizados com a bactéria E.coli não apresentaram nenhum efeito para os quatro PS estudados, nas concentrações de 100, 200 e 300 µg mL^-1, sabe-se que bactérias gram-negativas como a E.coli são pouco suscetíveis a TFD. Para os testes com a bactéria S.aureus, verificou-se que apenas a Phe apresentou uma pequena inibição de crescimento de 20,4% (bacteriostático), e um efeito fotodinâmico de 15,0% no teste bactericida, para a concentração de 300 µg mL^-1. Assim como para S.aureus, apenas a Phe apresentou ação fotodinâmica com relação à levedura C.albicans. Adicionalmente, tem-se a ocorrência de fortes reações de fotobranqueamento de Chl e ZnChl no meio trabalhado (surfactantes), e alto rendimento de ¹O₂ (com exceção da CuChl), fatores que vão de encontro aos resultados obtidos para os ensaios biológicos.

CONCLUSÕES:

O sistema de LED mostrou-se adequado para realização dos ensaios biológicos, com uma alta sobreposição com os PS. Apesar da clorofila e os demais derivados terem apresentado um bom desempenho da ação fotodinâmica contra a Artemia salina, os compostos praticamente não apresentaram efeito na inibição de crescimento das bactérias, a feofitina apresentou melhor desempenho nos ensaios ,in vitro, destacando-se uma boa ação fotodinâmica frente a C. albicans e demonstrando-se foto-estável no meio. Mesmo com o pequeno efeito apresentado pela Phe, de modo geral os quatro PS estudados não se mostraram promissores para aplicação em bactérias nos formulados estudados. A ineficácia de Chl e ZnChl nos testes biológicos são explicados em parte pela fotodecomposição intensa frente a luz, enquanto a CuChl, apesar de estável apresenta pequena formação de ¹O₂.

Instituição de fomento: CNPq

Trabalho de Iniciação Científica

Palavras-chave: Terapia Fotodinâmica, fotossensitizadores, micro-organismos.

E-mail para contato: adrianapassarella@yahoo.com.br