61ª Reunião Anual da SBPC
C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 5. Química de Macromoléculas
ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DE LECTINA PROVENIENTE DE SEMENTES DA ESPÉCIE VEGETAL Andira fraxinofolia (LEGUMINOSAE-FABACEAE)
Thaiz Batista Azevedo Rangel 1
Amanda Uliana de Carvalho 1
Kyria Santiago do Nascimento 2
Benildp Sousa Cavada 2
Patricia Machado Bueno Fernandes 1
1. Núc;eo de Biotecnologia, Universidade Federal do Espírito Santo/UFES
2. Departamento de Bioquímica, Universidade Federal do Ceará/UFC
INTRODUÇÃO:
Lectinas são proteínas de origem não imune, derivadas de plantas, animais ou microrganismos, que têm especificidade por resíduos de carboidratos. Desta forma, uma característica marcante dessa classe de proteínas é a capacidade de promover aglutinação de eritrócitos sem induzir modificações químicas nos mesmos (Liener et al., 1986). Em plantas, as lectinas representam um vasto grupo de proteínas concentradas predominantemente nas sementes, onde a concentração varia de 1 a 10% do valor total de proteínas (Peumans & Van Damme, 1998). Devido ao amplo espectro de atividades biológicas e singularidade de cada lectina, há um forte apelo aos estudos de suas funções fisiológicas e suas aplicações biotecnológicas. Para tanto, primeiramente se fazem necessárias as etapas de isolamento e caracterização das mesmas. Dessa forma, o presente estudo objetivou a identificação, isolamento e purificação de lectinas de sementes de plantas da Mata Atlântica do estado do Espírito Santo visando assim a bioprospecção de novas lectinas mediante o uso sustentável da biodiversidade capixaba
METODOLOGIA:
A) Identificação, a partir da lista florística da Mata Atlântica da Reserva de Sooretama, ES, de espécies vegetais passíveis de possuir lectinas. B) Preparo do extrato protéico: sementes trituradas até obtenção do pó, extração com solução de sulfato de amônio 1M por 4 h e centrifugação a 9000g a 4°C durante 20 min. C) Avaliação da atividade hemaglutinante do extrato protéico através de diluições duplo-seriadas em tampão adequado. Adição de suspensão de eritrócitos a 2%. D) Dosagem protéica total pelo método de Bradford. E) Inibição da atividade hemaglutinante por açúcares e glicoproteínas. F) Cromatografia de afinidade em manose-Sepharose: coluna equilibrada com solução de sulfato de amônio 1M e sobrenadante aplicado na coluna, eluída inicialmente com tampão de equilíbrio. Após eluição completa do pico não retido (PI) não ativo pela resina de afinidade, segundo pico (PII) foi eluído com adição de Tampão Glicina 0,1M com NaCl 0,15M, pH 2,6. O terceiro pico (PIII) foi eluído com Tampão Glicina 0,1M com NaCl 0,15M, pH 9,0. A fração ativa (PII) foi dialisada contra água destilada e liofilizada. G) Confirmação da pureza da lectina: cromatografia de troca iônica em coluna Hitrap SP XL 01 acoplada a HPLC. A lectina purificada foi dissolvida em água ultrapura (1mg/mL) e, após sua injeção foi utilizada concentração inicial de Tampão Acetato 20mM pH 4,5 com NaCl 1M por 20 minutos. H) Eluatos com atividade hemaglutinante foram separados SDS-PAGE (15%) .
RESULTADOS:
Extratos protéicos de Andira fraxinifolia apresentaram atividade hemaglutinante quando testados frente a eritrócitos papainizados de coelho, após 12h de incubação do extrato total. Resultados semelhantes foram encontrados com a lectina purificada. A atividade hemaglutinante da lectina de A. fraxinifolia foi inibida por manose em uma concentração de 0,025M. A cromatografia de afinidade em coluna manose-sefarose foi realizada para purificar o extrato protéico e finalmente isolar a lectina. O grau de pureza e a massa molecular aparente da proteína purificada e isolada foram determinadas por eletroforese em gel de poliacrilamida a 15%, utilizando-se lectina pura oriunda da cromatografia de afinidade, que apresentou um padrão de quatro bandas, de massa molecular aparente de 117, 85, 48 e 34kDa, respectivamente, sugerindo que a proteína é composta por mais de uma subunidade. A pureza da lectina da semente da espécie A. fraxinifolia também foi analisada por cromatografia de troca iônica em coluna Hitrap SP XL 01. Foi observado um pico único dotado de atividade hemaglutinante frente a eritrócitos papainizados de coelho. O padrão eletroforético da fração ativa proveniente da coluna de troca iônica foi semelhante ao apresentado para lectina pura, oriunda da cromatografia de afinidade .
CONCLUSÃO:
Foi possível purificar e isolar uma lectina da semente de Andira fraxinifolia. Tal lectina apresenta padrão de quatro bandas, de massa molecular aparente de 117, 85, 48 e 34kDa, possuindo, ainda, atividade hemaglutinante e inibição por manose a 0,025M. Mais estudos são necessários para entender a atividade biológica e a estrutura da lectina em questão .
Instituição de Fomento: Fundação de Apoio à Ciência e Tecnologia do Espírito Santo, Fundo de Apoio à Ciência e Tecnologia do Município de Vitória
Palavras-chave: uso sustentável, biodiversidade, lectina.