Dengue (DEN) é a principal arbovirose tropical transmitida ao homem através da picada de mosquitos hematófagos do gênero Aedes, sendo considerada problema de saúde pública na maior parte dos países das regiões tropicais e subtropicais do globo. Não existe vacina ou tratamento específico para DEN e os mecanismos implicados na evolução para as formas graves ainda não foram elucidados. Tanto fatores relacionados ao hospedeiro como ao vírus (mutações no genoma relacionadas à maior ou menor virulência) parecem estar envolvidos. O objetivo deste trabalho foi ensaiar através da tecnologia de genomas infecciosos, o papel de uma mutação identificada na proteína estrutural de envelope (E) de uma cepa neurovirulenta obtida através de passagens sucessivas da cepa parental DEN1 FGA/89 em cérebro de camundongo. A mutação está localizada em uma região muito conservada da E, proteína de grande importância por ser responsável pelas principais propriedades biológicas do vírus: principal componente antigênico, hemaglutinina viral, capacidade fusogênica com membranas da célula hospedeira, induz resposta imune protetora, interage com receptores na superfície de células alvo, e desempenha papel na patogenicidade de flavivírus, tanto pela definição do tropismo celular como pela penetração do vírus.

A metodologia consistiu na obtenção de um produto de DNA contendo a mutação de interesse na proteína de envelope por amplificação utilizando oligonucleotídeos mutagênicos. O produto obtido foi clonado em vetor de clonagem pGEM-T Easy (Promega) e posteriormente subclonado utilizando um clone infeccioso construído em um BAC (cromossomo artificial de bactéria) contendo a totalidade do genoma do vírus dengue sorotipo 1 cepa BR-90, a seqüência do genoma viral foi verificada após cada etapa de clonagem, para verificação da posição correta do inserto e também de mutações indesejadas. O genoma infeccioso contendo a mutação, pBACDV1/Emut, foi utilizado para caracterização in vitro do fenótipo viral, baseando-se nos dados de efeito citopático e presença e tamanho de foco, para tanto, células de glândula salivar de mosquito Aedes C6/36 foram transfectadas utilizando-de Lipofectina (Invitrogen) e mantidas em condições adequadas de 48 a 120h. Os sobrenadantes foram recolhidos e titulados pela técnica de Imunodetecção de Foco (FIA).

As reações de amplificação com oligonucleotídeos iniciadores específicos geraram dois produtos com os tamanhos esperados, que foram purificados e transformados em bactérias E.coli TOP10 cálcio-competentes. As colônias devidamente selecionadas foram crescidas e minipreparadas para obtenção do DNA plasmidial, que teve sua seqüência confirmada por sequênciamento nucleotídeo e foi posteriormente clonado no vetor comercial. O inserto correto contendo a mutação foi transferido para o genoma infeccioso gerando o clone pBACDV1/Emut. O clone foi transformado, minipreparado e teve sua seqüência nucleotídica confirmada por sequênciamento. Após nova confirmação da correta inserção da mutação, o clone foi submetido a reação de  transcrição in vitro, gerando o RNA com o tamanho esperado, que foi transfectado em células permissivas. Após os tempos de 48, 72, 96 e 120h de infecção, os sobrenadantes da transfecção foram recolhidos para titulação viral e caracterização da curva de crescimento do vírus recombinante. Os títulos foram de 6,25x101 ffu/mL no tempo de 48 horas, 5x102 ffu/mL em 72h, 8,75x103 ffu/mL em 96h e 1,12x105 ffu/mL em 120h.

Foi obtido e caracterizado o clone pBACDV1/Emut contendo a mutação na proteína E observada em vírus com fenótipos neurovirulentos em modelo murino. Os RNAs transcritos a partir do clone descrito acima foram capazes de gerar partículas virais em células permissivas. Conclui-se que a tecnologia de genomas infecciosos se mostra eficiente para caracterização biológica in vitro de vírus recombinantes. A obtenção deste clone infeccioso fornecerá subsídios para a elucidação do papel potencial da mutação na proteína de E no processo de neurovirulência, e também nas funções desempenhadas por esta proteína durante a infecção viral.