61ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 8. Genética - 4. Genética Molecular

OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO PRELIMINAR DE UMA BIBLIOTECA GENÔMICA ENRIQUECIDA COM REGIÕES DE MICROSSATÉLITES PARA BRACHYPLATYSTOMA CAPAPRETUM(SILURIFORMES: PIMELODIDAE)

Adriel Lira Cordeiro 1 Kyara Formiga de Aquino 1 Jacqueline da Silva Batista 1 José Antônio Alves-Gomes 1

1. Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia/INPA

INTRODUÇÃO:

A maior biodiversidade de peixes de água doce do mundo encontra-se na bacia Amazônica e grande parte do volume total de peixes capturados da bacia é composta pelo gênero Brachyplatystoma, da qual pertencem os grandes bagres migradores. Entre estes a piraíba negra (Brachyplatystoma capapretum, Lundberg & Akama, 2005), que apresenta sutis diferenças morfológicas em relação à piraíba (Brachyplatystoma filamentosum e, até então tidas como uma única espécie de bagres migradores, está entre os bagres de maior porte. Estudos de identificação e caracterização de estoques pesqueiros aliado ao estudo de genética de populações naturais são necessários serem realizados a fim de balizar políticas de conservação e manejo. Neste contexto, o projeto tem por objetivo construir e caracterizar uma biblioteca genômica enriquecida com regiões de microssatélites (Simple Sequences Repeats-SSR), classe de marcadores moleculares polimórficos e com alto grau de resolutividade para estudos populacionais, subsidiando tais estudos para essa espécie nova de bagre amazônico.

METODOLOGIA:

Para criação da biblioteca genômica foi seguida a metodologia de Billotte et al (1991) com modificações.Entre treze amostras de DNA genômico foi selecionado a amostra de DNA de um indivíduo de B. capapretum. O DNA genômico (5 ug) foi clivado com a enzima de restrição Rsa I, com sítio de corte GT↓AC. Foi feita a ligação dos fragmentos gerados à adaptadores por uma DNA T4 Ligase. O material foi amplificado via PCR (Polymerase Chain Reaction) e purificado seguindo protocolo do fabricante. Foi feita a seleção das regiões de SSRs por hibridização de sondas, com seqüências nucleotídicas em repetição (CT)8 e (GT)8, e utilizando micro-esferas magnéticas. Os fragmentos foram selecionados após magnetização do material e ligados em vetor pGEM-T (ProMega). A transformação bacteriana foi realizada por choque-térmico, levando as bactérias de -20°C à temperatura ambiente, e adição de IPTG e X-GAL, indutores e detectores de β-galactosidase respectivamente, (Avi Levy, 1991). Foram selecionadas as colônias em que a coloração do substrato não foi alterada. Foi realizada PCR das colônias selecionadas para verificação de insertos. O DNA plasmidial extraído e seqüenciado com kit de seqüenciamento Big Dye Terminator e eletro-injetado em seqüenciador automático ABI 3130. As seqüências foram analisadas nos programas CHROMAS 2.33, para visualização de eletroferogramas, BIOEDIT 5.0.9, para edição das seqüências e WEBTROLL, para caracterização da biblioteca e desenho de iniciadores de PCR.

RESULTADOS:

Foi obtida uma biblioteca genômica de B. capapretum composta por duas placas de bactéria recombinantes contendo 96 clones/cada. O DNA plasmidial de todos os clones foi extraído e somente um clone não apresentou inserto. Ate o momento foi obtida a seqüência nucleotídica de 64 clones, Destes, quatro clones apresentaram seqüências sem SSRs. Foi verificada a presença de 66 SSRs na biblioteca, onde 73% dos SSRs apresentaram-se como SSRs perfeitos, 18,1% como SSRs interrompidos, 4,5% compostos, 1,5% como imperfeitos, 1,5% como compostos imperfeitos e 1,5% como compostos interrompidos. Um SSR apresentou motivo de repetição do tipo Tetranucleotídico, tendo os demais motivos de repetição Dinucleotídicos.

CONCLUSÃO:

O protocolo ajustado para clivagem do DNA genômico e manipulação de bactérias recombinantes mostrou-se eficiente para a obtenção de uma biblioteca genômica enriquecida com SSR a partir da qual foram obtidas seqüências nucleotídicas adequadas para o desenho de iniciadores de PCR e posterior isolamento de marcadores microssatélites para a referida espécie.

Instituição de Fomento: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas, Instituto Nacional de Pesquisas d

Palavras-chave: piraíba, microssatélites, biblioteca genômica.