61ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 1. Biologia Molecular

O EFEITO ANTITROMBÓTICO IN VIVO DA FUCANA A DA ALGA MARINHA Spatoglossum schröederi É DEPENDENTE DA DISTRIBUIÇÃO DE GRUPAMENTOS SULFATO E CARBOXILA NA MOLÉCULA

Valquiria Pereira de Medeiros 1, 3 Edvaldo da Silva Trindade 2 Fabio Nascimento 1 Edda Lisboa Leite 3 Hugo Alexandre de Oliveira Rocha 3 Helena B. Nader 1, 4

1. Disciplina de Biologia Molecular, Depto Bioquímica, UNIFESP/EPM-São Paulo-SP 2. Departamento Biologia Celular, UFPR-Curitiba-PR 3. Departamento Bioquímica, UFRN-Natal-RN 4. Orientadora

INTRODUÇÃO:

Algas marinhas marrons são constituídas por uma variedade de polissacarídeos ácidos tais como ácidos algínicos e fucanas. Fucana é o termo usado para definir uma família de polissacarídeos complexos que contêm -L-fucose sulfatada. A alta densidade de cargas negativas das fucanas pode estar relacionada às atividades biológicas apresentadas por estes polissacarídeos. Trabalhos anteriores mostram que as fucanas de algas marinhas apresentam ações farmacológicas como potenciais drogas anticoagulante, antitrombótica, antitumoral, antiinflamatória, dentre outras. No entanto, a relação entre detalhes estruturais e a atividade biológica das fucanas ainda não estão claramente estabelecidas. Neste trabalho, será investigada a relação entre a estrutura e a atividade anticoagulante e antitrombótica da fucana A extraída da alga marinha marrom Spatoglossum schröederi.

METODOLOGIA:

Fucana A purificada da alga Spatoglossum schröederi foi submetida a carboxirredução e dessulfatação. A fucana A nativa (nFucA), carbozirreduzida (cFucA), parcialmente (dFucA2h) e totalmente (dFucA8h) dessulfatadas foram avaliadas por métodos químicos e físico-químicos, incluindo dicroísmo circular. O efeito anticoagulante in vitro foi investigado pelo método da USP, e a atividade antitrombótica in vivo pela trombose venosa induzida pela ligadura da veia cava inferior, em ratos da linhagem Wistar. O efeito na síntese do heparam sulfato (HS) antitrombótico foi realizado incubando-se células endoteliais da aorta de coelho, na presença ou ausência de fucana A nativa ou modificadas. Para estudos de internalização e degradação, a fucana foi quimicamente modificada introduzindo-se biotina em determinadas carboxilas dos resíduos de ácido urônico. Esse probe foi empregado para quantificar o número de sítios e a constante de ligação a células endoteliais, por um ensaio ELISA-like empregando-se estreptavidina conjugada com európio. Ainda, foram realizados estudos citoquímicos para detecção do local de ligação à célula, por microscopia confocal. Heparina de pulmão bovino foi empregada como controle positivo de todos os estudos.

RESULTADOS:

A fucana A não apresentou atividade anticoagulante in vitro, no entanto, mostrou uma potente atividade antitrombótica in vivo de maneira dose e tempo-dependente. Ainda, o composto nativo aumenta a síntese do heparam sulfato antitrombótico em células endoteliais, de forma dose-dependente. Entretanto, este efeito estimulatório foi abolido para a dFucA8h e reduzido em 20% para a cFucA. O efeito da fucana A no estímulo da síntese do HS não depende da internalização do polissacarídeo, evidenciado por experimentos realizados a 4C nem da degradação, pois em presença de cloroquina, que inibe atividade lisosomal, a atividade é mantida. A competição entre a heparina e a fucana A sugerem que a fucana A possivelmente compete pelos sítios de ligação da heparina em células endoteliais, localizados na matriz extracelular. A ligação da fucana A na matriz extracelular mostrou um KD aparente de 20 ± 3 nM e um número de sítios de ligação de 0,16 ± 0,009.106. A ligação da fucana A à matriz extracelular foi confirmada por microscopia confocal, onde a fucana A apresentou uma marcação do tipo fibrilar bem como co-localização com fibronectina, sugerindo que o efeito antitrombótico da fucana A é determinado pela sua capacidade de se ligar a moléculas da matriz extracelular de células endoteliais.

CONCLUSÃO:

Os resultados mostraram que a fucana A da alga Spatoglossum schröederi é um agente antitrombótico potente, e que apresenta efeito mais prolongado do que a heparina em um modelo de trombose venosa em ratos. Ainda, a capacidade da fucana de aumentar a síntese do heparam sulfato antitrombótico pelas células endoteliais, fala a favor desse efeito antitrombótico prolongado. Como a heparina, o efeito é mediado pela ligação da fucana à matriz extracelular das células endoteliais, possivelmente via interação como fibronectina e sinalização via integrina. A sulfatação é fundamental para o efeito, pois 50% de redução no conteúdo de sulfato abole o efeito celular e na trombose venosa. Por outro lado, redução de 60% nas carboxilas leva a uma diminuição de somente 20% dos efeitos. Assim, os dados sugerem que sulfatação é fundamental para a atividade biológica da fucana A.

Instituição de Fomento: CNPq, CAPES e FAPESP

Palavras-chave: Fucanas, atividade anticoagulante/antitrombótica, matriz extracelular.