61ª Reunião Anual da SBPC
C. Ciências Biológicas - 13. Parasitologia - 1. Entomologia e Malacologia de Parasitos e Vetores
DETECÇÃO DE Wolbachia (RICKETTSIALES, RICKETTSIACEAE) EM MOSQUITOS (DIPTERA, CULICIDAE) DA AMAZÔNIA PELA AMPLIFICAÇÃO DO GENE WSP.
Ricardo Augusto dos Passos 1
Waléria Dasso Pinheiro 2
Joaquim Carlos Freire da Silva 2
Wanderli Pedro Tadei 3
1. Fundação de Vigilância em Saúde - FVS/AM, Doutorando Entomologia - INPA
2. Bolsista Laboratório de Malária e Dengue - INPA
3. Pesquisador Dr. Laboratório de Malária e Dengue - Orientador
INTRODUÇÃO:

Wolbachia é um grupo comum de bactéria amplamente distribuído e encontrado nos tecidos reprodutivos dos artrópodes. Elas são simbiontes intracelulares obrigatórios e estão universalmente presentes em muitas espécies de invertebrados, incluindo mosquitos dos gêneros Culex e Aedes. A infecção por Wolbachia está associada a diversas alterações reprodutivas do hospedeiro, incluindo incompatibilidade citoplasmática (IC). Com a IC, machos infectados são reprodutivamente incompatíveis com fêmeas não infectadas (eles são parcialmente ou completamente estéreis). As fêmeas infectadas são reprodutivamente compatíveis com ambos os machos infectados e não infectados (Stouthamer et al. 1999). O fenômeno de IC dá uma vantagem reprodutiva a Wolbachia em infectar as fêmeas, pois permite se espalhar rapidamente entre as populações hospedeiras (Turelli e Hoffmann 1999). A habilidade da Wolbachia em expandir tem gerado grande interesse no uso deste simbionte como um mecanismo para direcionar a introdução de características transgênicas dentro de populações de vetores visando o controle de doenças transmitidas por mosquitos, como a dengue e a malária (Rasgon e Scott, 2003). Neste contexto, o objetivo deste estudo foi realizar a detecção de Wolbachia em mosquitos por meio da amplificação do gene wsp.

METODOLOGIA:

Foram coletadas larvas de Aedes e Culex em criadouros artificiais de ambiente urbano em Manaus, e mantidas em laboratório até a emergência do adulto. Os mosquitos adultos dos gêneros Anopheles, Mansonia e Coquillettidia foram coletados com aspirador manual em áreas de mata, nos municípios de Coari e Rio Preto da Eva. O DNA foi extraído individualmente usando o método Chelex 100. A análise dos mosquitos infectados por Wolbachia foi realizada por meio da técnica molecular de Reação de Polimerase em Cadeia (PCR), utilizando os iniciadores de seqüência wsp81f e wsp691r. Os iniciadores foram desenhados a partir de genes de proteínas de superfície de Wolbachia, denominado wsp (Zhou et al., 1998). Iniciadores wsp grupo-específico foram utilizados para classificar a Wolbachia dentro dos maiores grupos A e B. Em cada amostra, 4 μl dos produtos da PCR foram aplicados em um gel de agarose 1%, em tampão ETBr e os fragmentos foram gerados por eletroforese a 100V, por cerca de 60 minutos. Em cada gel foi incluído DNA de 1kb ladder (GIBCO) como padrão para determinar a presença e o tamanho do DNA amplificado (peso molecular). Foi utilizado corante fluorescente no momento da aplicação da amostra no gel e após a eletroforese, os géis foram visualizados em luz ultravioleta e fotografados.

RESULTADOS:

Foram analisados 223 espécimes de mosquitos, dos quais 84 exemplares foram de Ae. albopictus, 46 de Cx. quinquefasciatus, 33 de An. darlingi, 16 de Ae. aegypti, 26 Ma. amazonensis, 15 de Ma. titilans, um de Ma. humeralis, um de Cq. Venezuelensis e um Cx. (Mel). Das 84 amostras de Ae. albopictus analisadas, 78,5% (66) estavam positivas para Wolbachia, sendo destes, 77% (51) fêmeas e 23% (15) machos. Para Cx. quinquefasciatus, a taxa de infecção foi de 87% (40), sendo destes, 40% (16) machos e 60% (24) fêmeas. As 16 amostras de Ae. aegypti analisadas eram fêmeas e estavam negativas. A freqüência em Ma. amazonensis (fêmeas) foi 11.5%, de Ma. titilans 13%. As amostras de Ma. humeralis e Cq. venezuelensis (fêmeas) foram positivas. Entretanto, as 33 amostras de An. darlingi (fêmeas) e uma de Cx. (Mel.) foram todas negativas para a presença de Wolbachia. A caracterização do grupo A e B de Wolbachia foram realizadas em 37 amostras de Ae. albopictus, sendo encontrado destas 11 amostras positivas para o grupo A, 19 amostras positivas para o grupo B e, em 7 amostras, foram encontras a infecção dupla pelos grupos A e B.

CONCLUSÃO:

A detecção de Wolbachia via PCR indica que ela esta amplamente distribuída e freqüentemente encontrada infectando diferentes espécies de mosquitos neotropicais. Neste trabalho, seis espécies foram encontradas infectadas, sendo este o primeiro registro para a região amazônica. Neste estudo, foram detectadas taxas elevadas de infecção para as espécies Ae. albopictus e Cx. quinquefasciatus. No entanto, as espécies Ae. aegypti e An. darlingi não foram encontradas infectadas por Wolbachia. Esses dados corroboram com trabalhos que encontraram diversos gêneros de mosquitos infectados, assim como, a ausência da infecção no vetor da dengue, o Ae. aegypti e, nas espécies de Anopheles. Estudos envolvendo a transferência experimental da bactéria em Ae. aegypti e An. darlingi são necessários para descrever o possível impacto que a infecção por Wolbachia poderá ter na história de vida destes mosquitos. A detecção da infecção dos grupos A e B nas diferentes espécies e a sua caracterização dentro dos subgrupos podem indicar a diversidade de Wolbachia em seus hospedeiros. As demais amostras deste estudo serão analisadas para a presença dos grupos A e B e, posteriormente, as mesmas serão seqüenciadas para a caracterização dos subgrupos e confirmação dos resultados.

Instituição de Fomento: CNPq/PETROBRAS/FINEP/CTPETRO/PIATAM.
Palavras-chave: Wolbachia, Mosquitos, gene wsp.