Em estudos da interação entre Theobroma cacao L. e Monilliophytora perniciosa foram identificadas quatro sequências de cistatinas em bancos de dados de bibliotecas sequenciadas no Laboratório de Genômica da UESC. As fitocistatinas são inibidores de cisteíno-proteases. Essas cistatinas estão relacionadas com estresses bióticos, incluindo defesa contra fungos, insetos, vírus, nematódeos e bloqueio da morte celular programada (PCD), por inibirem as cisteíno-proteases envolvidas nesse fenômeno. As quatro ORFs nomeadas TcCYS1, TcCYS2, TcCYS3 e TcCYS4 codificam proteínas com 209, 127, 124 e 205 resíduos de aminoácidos, respectivamente. Análises in silico revelaram que TcCYS2 e 3 tem massa de cerca de 13,5 kDa e possuem o domínio clássico de inibição de papaína [QVV(A/S)G]. TcCYS1 e 4 são proteínas com 23 a 24 kDa, contendo a sequência SNSL que é inibidora de leguminas. Uma proteína do fungo (NEP - necrosis and ethylene-inducing proteins) foi caracterizada recentemente em nosso laboratório. A infiltração de NEP em tecidos de tabaco induz PCD, ao ativar cisteíno-proteases. Nesse trabalho objetivamos expressar as cistatinas (TcCYS1, TcCYS3 e TcCYS4) do cacau em tabaco, para futuros estudos do efeito dos transgenes na fisiologia da planta e na resposta a infiltração da proteína NEP.

Os fragmentos de cDNA de TcCYS1 e 3 foram amplificados por PCR e inseridos no vetor de clonagem pGEMTeasy (PROMEGA), por meio de reação com T4 DNA Ligase. O fragmento amplificado de TcCYS4 foi inserido no vetor pTZ57R/T. Os fragmentos de TcCYS1 e 3 foram liberados de pGEMTeasy com a enzima BamHI, enquanto TcCYS4 foi liberado do pTZ57R/T com EcoRI. Os fragmentos foram inseridos no vetor de transformação de plantas, pCambia 1390 (Cambia Vectors) flanqueados pelo promotor CaMV35S e terminador NOS, nomeado pUESC28. A orientação de clonagem no pUESC28 foi analisada por PCR com primers para as cistatinas e para o terminador NOS. Os clones na orientação senso foram usados para transformar a estirpe de Agrobacterium tumefaciens EHA105. Os transformantes foram confirmados por PCR de colônia e utilizados para transformação de explantes de tabaco (Nicotiana tabacum), por meio da técnica de co-cultivo em meio líquido. Os calos e brotos potencialmente transformados foram selecionados em meio com higromicina. A eliminação da agrobactéria foi feita com o uso do antibiótico Timentin. As plantas transformadas foram confirmadas por PCR e estão sendo micropropagadas em frascos tipo magentas. Proteínas foram extraídas pelo método do ADP, para análise da expressão dos transgenes por western blot.

Os cDNAs das cistatinas do cacau TcCYS1, 3 e 4 foram amplificados por PCR, de acordo com análise em gel de agarose. Os fragmentos amplificados foram clonados eficientemente nos vetores de clonagem de produtos de PCR, pGEMTeasy, para TcCYS1 e 3 e pTZ57R/T, para TcCYS4, conforme teste de PCR de colônias. Os fragmentos liberados com EcoRI, para TcCYS1 e 3 e com BamHI, para TcCYS4 foram inseridos em pUESC28 (pCambia1390, contendo o promotor CaMV35S e o terminador NOS), digerido com as respectivas enzimas, nas orientações senso e antisenso, conforme diagnóstico por PCR. A estirpe EHA105 de A. tumefaciens foi transformada com os clones senso das três cistatinas em estudo. Após co-cultivo de explantes com agrobactéria e calogênese, 30 plantas de tabaco para cada cistatina foram regeneradas em meio seletivo contendo higromicina. O PCR do DNA genômico de 10 plantas para cada clone confirmou a presença dos transgenes de cistatinas do cacau. As proteínas de folhas desses clones foram extraídas e dosadas e estão sendo submetidas à análise de expressão das cistatinas do cacau, por meio de western blot. Após essas análises, as plantas com super-expressão serão aclimatadas em casa de vegetação para realização de avaliações fisiológicas e de efeito da proteína NEP.

Os genes codificadores das cistatinas TcCYS1, TcCYS3 e TcCYS4 foram eficientemente clonados em plantas de tabaco com a utilização do vetor pUESC28 (pCambia modificado), usando Agrobacterium tumefaciens. A implicação desses transgenes na fisiologia da planta inteira precisa ser analisada, bem como os seus possíveis efeitos em bloquear a ação da proteína indutora de necrose, NEP, do fungo M. perniciosa. Esses serão os primeiros testes para analisar a hipótese de que cistatinas ao inibir cisteíno-proteases ativadas pela NEP, bloqueiam a sua ação em promover PCD. Nesse caso, as cistatinas utilizadas TcCYS1 e 3 são endereçadas para a rota secretora, enquanto TcCYS4 é uma proteína com provável localização citoplasmática, de forma que o efeito da localização da proteína também será analisado. Além disso, o sítio de inibição de leguminas está presente em TcCYS1 e 4 e ausente em TcCYS3, portanto, o seu efeito também será analisado. Esses testes serão executados em próximas etapas, quando as plantas de cacau geneticamente transformadas estiverem aclimatadas em casa de vegetação.