Chromobacterium violaceum é uma bactéria de vida livre presente em ecossistemas tropicais e subtropicais, que é abundante nas margens do Rio Negro, e tem sido estudada no Brasil nos últimos trinta anos. O genoma completo da bactéria foi sequenciado e anotado e as sequências estão disponíveis para consulta pública no GenBank (Brazilian National Genome Project Consortium, 2003). Entre os produtos do metabolismo da C. violaceum que apresentam atividade anti-microbiológica (Duran & Menck, 2000; Matz et al., 2004), estão a violaceína, que não é difusível, e quitinases, ambas expressas em resposta ao mesmo mecanismo de quorum sensing (Chernin et al., 1998). A atividade de quitinases sobre o micélio de Colletotrichum gloesporioides foi demonstrada (Sandhya et al., 2005). Além de violaceína e quitinases, podem existir outras proteínas e peptídeos expressos pela bactéria que apresentem atividade antifúngica. O objetivo deste trabalho foi testar extratos proteicos de C. violaceum fracionados por diferenças de solubilidade dos seus componentes quanto à atividade inibitória da protrusão de hifas de Colletotrichum sp. isolado de folhas de guaranazeiro (Paullinia cupana var. sorbilis) com sintomas de antracnose, principal doença dos guaranazais no Amazonas.

Os esporos de Colletotrichum sp. foram fornecidos pelo Laboratório de Fitopatologia da Embrapa Amazônia Ocidental (Manaus/AM). O cultivo de C. violaceum, cepa ATCC12472, em meio M9 (meio mínimo, Sambrook et al., 1989). A extração, que incluiu procedimento para eliminar a violaceína das amostras, e o fracionamento por solubilidade das proteínas (ptns) foram realizados nos laboratórios da FIOCRUZ. Foram testadas frações hidrofílicas, sendo: A – ptns intracelulares e B – ptns extracelulares, recolhidas do meio após o cultivo. Os tratamentos de interação com os esporos foram:

T1: 300 mg de ptns da fração A, por 6 h

T2: 1200 mg de ptns da fração A, por 6 h

T4: 300 mg de ptns da fração B, por 6 h

T5: 1200 mg de ptns da fração B, por 6 h

T7: 400 mg de ptns da fração A, por 4 h

T8: 1600 mg de ptns da fração A, por 4 h

T10: 400 mg de ptns da fração B, por 4 h

T11: 1600 mg de ptns da fração B, por 4 h

Os tratamentos 3, 6, 9 e 12 foram controles (esporos sem interação com ptns). A temperatura de 28 ^oC foi mantida durante a interação. A variável analisada foi a razão entre o número de esporos para os quais foi observada a protrusão de hifas, passadas duas, quatro ou seis horas de interação com as frações protéicas, dividido pelo número total de esporos contados por campo. A contagem dos esporos foi realizada ao microscópio, utilizando aumento de 40X e os campos de observação foram tomados como repetições. Para análise foi utilizado o teste Z para proporções (Fox et al., 1985), a 5% de probabilidade.

Não foi observada germinação de esporos nas primeiras duas horas, sob qualquer condição. A fração intracelular apresentou maior atividade de inibição de germinação dos esporos do que a fração extracelular. Da fração A (intracelular), 300 e 1200 μg de proteínas, em interação por 6 h, diferiram significativamente e 1200 μg foram mais efetivos do que 300 μg quanto à inibição da germinação dos esporos de Colletotrichum. Uma vez que os resultados obtidos usando 400 μg não diferiram dos obtidos com 1600 μg, em interação por 4 h, é provável que a partir de 400 μg o componente ativo desta fração proteica seja efetivo independente do tempo de reação. A atividade antagônica da fração B (extracelular) só diferiu do controle quando observada por 4 h de experimentação. Os 400 μg das proteínas da fração B inibiram a germinação de uma proporção maior de esporos de Colletotrichum do que 1200 μg durante um tempo maior (6 h) de interação. Uma hipótese para explicar estes resultados é que a atividade das proteínas presentes nesta fração reduziu-se ao longo do tempo de observação e perdeu-se na avaliação de 6 h. Não houve diferença entre as duas quantidades das proteínas da fração B utilizadas nos experimentos com duração de 6 h.

Existem componentes/especimens proteicos capazes de inibir a germinação de esporos de Colletotrichum sp. isolado de plantas de guaranazeiro tanto entre as proteínas hidrofílicas intracelulares quanto extracelulares encontradas no meio M9 colonizado por Chromobacterium violaceum.  

Agradecimentos: ao Técnico do Laboratório de Biologia Molecular da Embrapa Amazônia Ocidental, Jeferson Chagas da Cruz, que realizou a contagem dos esporos.