61ª Reunião Anual da SBPC
C. Ciências Biológicas - 7. Fisiologia - 2. Fisiologia Comparada
Perfil da expressão gênica e atividade enzimática da pepsina em larvas e juvenis de tambaqui, Colossoma macropomum.
Katherine López Vásquez 1
Ramon Barros Baptista 1
Karen Yuri Suguiyama da Silva 1
Sérgio Ricardo Nozawa 2
Vera Maria Fonseca de Almeida e Val 1
Adalberto Luis Val 1
1. Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia/INPA
2. Centro Universitário Nilton Lins
INTRODUÇÃO:

Os principais itens alimentares disponíveis na natureza e que fazem parte da dieta do tambaqui são frutas, sementes e um conjunto de outros itens que inclui zooplâncton, insetos e algas. A disponibilidade desses itens varia de acordo com as flutuações no nível da água. Devido ao seu hábito alimentar, o tambaqui  tem seu metabolismo ajustado, para digerir alimentos tanto de origem animal como vegetal. Contudo, a maquinaria enzimática envolvida com a digestão de tão variada dieta tem sido muito pouco estudada até o presente momento. Mesmo não dispondo desse tipo de informação, o desenvolvimento de técnicas de reprodução e cultivo desta espécie tem sido amplamente buscado e requer informações complementares que possam auxiliar no aumento do rendimento quando de sua criação. A pepsina é uma protease que hidrolisa proteínas no estômago e já foi detectada em diversas espécies de teleósteos, de modo que esta e outras proteases têm sido propostas como indicadoras do estado nutricional e do aparecimento e funcionamento dos órgãos digestivos nos peixes. O objetivo deste trabalho foi determinar a atividade e a expressão gênica da pepsina durante o desenvolvimento larval do tambaqui.

METODOLOGIA:

 Ovos e larvas inteiros e estômagos de juvenis de tambaqui foram coletados no Centro de Tecnologia, Treinamento e Produção em Aqüicultura – CTTPA localizado a 170 km da cidade de Manaus no Município de Balbina, Amazonas e congelados a -70°C até posterior análise. O RNA total foi isolado utilizando o reagente TRIzolâ (Invitrogen Life Technologies. O cDNA sintetizado a partir do RNA total livre de DNA genômico foi usado como molde para amplificação por qRT-PCR com SYBR® Green PCR Master Mix da Applied Biosystems, CA. Os iniciadores foram desenhados a partir de seqüências específicas de pepsinogênio de tambaqui disponíveis (López-Vásquez, 2008). Os resultados da expressão foram analisados utilizando-se a quantificação relativa, calculada a partir do ∆∆Ct. A normalização da expressão do gene foi feita a partir da expressão do gene 18s (gene controle). O calibrador utilizado para as análises foram amostras de juvenis com 90 dias após eclosão (DAE). A proteína solúvel nos extratos enzimáticos foi determinada segundo o método de Lowry (1951). A atividade da pepsina foi quantificada pelo método de Worthington, (1972). A significância estatística das diferenças entre grupos foi estabelecida por meio de análise de variância ANOVA e posterior teste de comparação múltipla de Tuckey, com limite de significância de 1%.

RESULTADOS:

Os resultados da análise de amplificação por qRT-PCR do gene precursor de pepsina evidenciaram diferença de amplificação de transcritos entre as fases de desenvolvimento do tambaqui. Larvas movimentando se na cápsula ovular já apresentavam amplificação de transcritos embora atividade enzimática não tenha sido detectada nesta fase. A maior intensidade dos fragmentos foi observada 36 HAE e a menor 16 DAE. Atividade da pepsina foi detectada em larvas 1 HAE (0,595 ± 0,01 U/mg de proteína), mantendo se relativamente constante até 60 HAE, quando aumenta significativamente até alcançar máxima atividade em 108 HAE (2,431 ± 0,108 U/mg de proteína) diminuindo em seguida até o valor mínimo aos 90 DAE (0,422 ± 0,003 U/mg de proteína). Segundo Dabroswki, 1984 algumas larvas de peixes já apresentam um estômago funcional antes mesmo da mudança da alimentação endógena para a exógena. Tal é o caso de larvas de salmonídeos e ciclídeos, que apresentam glândulas gástricas antes da absorção total da reserva vitelínica. Já outras espécies de peixes como larvas do bagre africano Clarias gariepinus e do acará-disco Symphysodum aequifasciata apresentam atividade da pepsina cerca de cinco a seis dias após a formação do estômago (Verreth et al., 1992; Chong et al., 2002).

 

CONCLUSÃO:

A elevada atividade de pepsina nos primeiros estágios de desenvolvimento do tambaqui sugere que no momento da abertura da boca e início da alimentação exógena, este peixe apresenta a capacidade de digestão extracelular de proteínas completamente funcional. O perfil de expressão e atividade da pepsina sugere que a atividade desta enzima é regulada após transcrição. Estudos complementares da expressão de genes associados à atividade de outras enzimas proteolíticas poderiam ajudar na compreensão da real capacidade digestiva em larvas e juvenis de tambaqui determinando o momento adequado para a primeira alimentação. Isso possibilita direcionar a escolha dos ingredientes e a proporção dos nutrientes energéticos e estruturais para elaboração de uma ração adequada ao estágio de desenvolvimento.

Instituição de Fomento: Trabalho financiado pelo Projeto Pronex (CNPq), FAPEAM, INPA CAPES
Palavras-chave: Expressão gênica, Pepsina, Colossoma macropomum.