61ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 10. Microbiologia - 1. Biologia e Fisiologia dos Microorganismos

ANÁLISE COMPARATIVA DE POLIMORFISMOS PROTEICOS ENTRE AS CEPAS CANTAGALO E IOC DO VIRUS VACCINIA

P. P. Afonso 1 L. M. S. Lery 1 W. M. A. Von Krüger 1 P. M. Bisch 1 C. Damaso 1

1. Universidade Federal do Rio de Janeiro, CCS, IBCCF

INTRODUÇÃO:

O vírus vaccinia (VACV), membro protótipo da família Poxviridae, foi usado na vacinação antivariólica até final de 1970. O vírus Cantagalo (CTGV) foi isolado em 1999 de lesões pustulares nas tetas de gado bovino leiteiro e retireiros durante surtos no município de Cantagalo, no Rio de Janeiro. O CTGV foi caracterizado como uma cepa de VACV e sua origem foi sugerida como sendo um escape da cepa IOC de VACV usada na campanha de vacinação antivariólica brasileira. Apesar de filogeneticamente relacionados, a caracterização do CTGV e do VACV-IOC revelou a presença de vários polimorfismos em seus genomas. Neste estudo, nós estabelecemos as condições apropriadas para iniciar uma análise proteômica comparativa, objetivando a identificação de proteínas estruturais expressas diferencialmente entre os dois vírus. Este modelo de estudo com vírus filogeneticamente tão próximos é relevante por poder levar-nos a entender mais sobre a biologia desses vírus e sobre como ciclos recorrentes de infecção podem ter influenciado no estabelecimento e sucesso do CTGV na natureza.

METODOLOGIA:

O CTGV e o VACV-IOC foram propagados em células BSC-40 e purificados por sedimentação em gradiente de sacarose 25-40%. Análise por Western blot usando anticorpo anti-proteínas totais de VACV mostraram diferenças nos perfis protéicos de ambos os vírus na faixa de 30 a 40 kDa, corroborando nossas observações anteriores e confirmando a ausência de contaminação cruzada. As proteínas dos vírus purificados foram satisfatoriamente solubilizadas em tampão contendo detergente, seguido de incubação com 8M uréia/2M tiouréia. Para as análises em gel-bidimensional, nós obtivemos os melhores resultados em tiras de 7 cm com faixa de pH de 3-10. Após a focalização, as tiras foram submetidas à eletroforese em SDS-PAGE 15%, seguido de coloração com azul de Coomassie. Quatro géis foram obtidos de diferentes amostras para cada vírus. O programa ImageMaster Platinum foi usado para analisar as imagens dos géis e detectar os spots. Um gel referência para cada vírus foi obtido sobrepondo os 4 géis e os spots diferencialmente representados analisados. Os spots de interesse foram removidos, tripsinizados e processados para espectrometria de massas (MS e MS/MS).

RESULTADOS:

Um total de 52 spots do CTGV e 25 do VACV-IOC foram detectados como estando ausentes no outro vírus. Dois outros spots foram pelo menos três vezes mais expressos em VACV-IOC do que em CTGV. De todos spots processados que geraram bons espectros, 74% destes foram adequadamente identificados. As proteínas identificadas codificadas por CTGV foram: F13, D3, A10, A3, H1 e E3 e, por VACV-IOC: F13, D3, A10 e I3. Também foram identificadas proteínas celulares associadas às partículas virais. Nossos dados sugerem uma maior expressão da proteína F13 por VACV-IOC em relação ao CTGV, o que poderia ser correlacionado a outras diferenças entre os vírus como o fenótipo da placa viral e a sensibilidade ao antiviral ST-246. Supostas isoformas expressas diferencialmente entre ambos os vírus também são sugeridas.

CONCLUSÃO:

Este foi o primeiro trabalho a comparar o proteoma de duas cepas de VACV distintas, assim como a estudar, pela primeira vez, o proteoma de CTGV e VACV-IOC. A abordagem proteômica foi capaz de evidenciar diferenças que necessitam ser melhor estudadas, podendo permitir um maior entendimento sobre a biologia destes vírus, assim como sobre a relação vírus-hospedeiro.

Instituição de Fomento: CNPq, Faperj, UFRJ, e IFS

Palavras-chave: Vírus Vaccinia, Proteoma, Vírus Cantagalo.