61ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 8. Genética - 4. Genética Molecular

CARACTERIZAÇÃO DE UMA BIBLIOTECA GENÔMICA ENRIQUECIDA COM REGIÕES DE MICROSSATÉLITES PARA Anopheles darlingi (DIPTERA: CULICIDAE)

Graciela Nascimento Lima 1 Jacqueline da Silva Batista 1 Juracy de Freitas Maia 1 Kyara Formiga de Aquino 1 Wanderli Pedro Tadei 1 Joselita Maria Mendes dos Santos 1

1. Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia/INPA

INTRODUÇÃO:

Anopheles darlingi do subgênero Nyssorhynchus é considerada a mais importante transmissora da malária humana em todo o país, e particularmente, na Amazônia. Esta espécie é a mais antropofílica e endofágica de todas as espécies de Anopheles nas Américas. Neste contexto, a biologia molecular, por meio de diferentes marcadores moleculares tem contribuído substancialmente para conhecer a estrutura genética populacional e entender os mecanismos envolvidos na dinâmica de transmissão da malária desse vetor. Entre os marcadores moleculares utilizados, os microssatélites (SSR) vêm sendo muito eficientes em estudos populacionais por apresentar um elevado índice de polimorfismo. Apesar da importância epidemiológica de A. darlingi, ainda são poucos os estudos utilizando microssatélites em populações dessa espécie.  Apenas oito locos microssatélites foram desenvolvidos para essa espécie. O presente trabalho tem por objetivo desenvolver e caracterizar uma biblioteca genômica enriquecida com regiões de microssatélites para A. darlingi e aumentar o número de locos polimórficos a serem utilizados em estudos populacionais.

METODOLOGIA:

A biblioteca genômica enriquecida com regiões microssatélites foi obtida a partir do protocolo.de Billotte et al. (1999) com adaptações. As amostras de DNA genômico foram obtidas de uma única população (Coari), utilizando um pool de DNA de 10 mosquitos adultos. O DNA genômico foi digerido com a enzima RsaI (10U/μl), de sítio de restrição em (5’)GT¯AC(3’). Foi feita a ligação dos adaptadores aos fragmentos gerados na presença da enzima T4 DNA ligase. O material foi amplificado por PCR e purificado com o kit Quiack seguindo protocolo do fabricante. A seleção de fragmentos contendo microssatélites foi feita por hibridização, utilizando duas sondas (CT)8 e (GT)8 marcadas com biotina, e utilizando micro-esferas magnéticas envolvidas com estreptavidina. Os fragmentos selecionados foram ligados em vetor pGEM-T (ProMega) e a transformação bacteriana foi realizada por choque-térmico, seguida da adição de IPTG e X-GAL. Foram selecionadas as colônias sem alteração de coloração. Para certificar-se que os clones transformados contêm os insertos foi feita à amplificação dos clones por PCR. Foi extraído o DNA plasmidial, e o sequenciamento nucleotídico foi realizado com kit Big Dye Terminator V3.1, eletro-injetado em analisador automático de DNA ABI 3130. As seqüências de DNA foram analisadas com o auxílio dos programas CHROMAS 2.23 e BIOEDIT 7.0.0.9, e o programa WEBTROLL e PRIMER3 para caracterização da biblioteca e desenho dos iniciadores de PCR.

RESULTADOS:

Foi obtida uma biblioteca genômica de A. darlingi contendo 96 clones todos com inserto. Foi obtida a seqüência nucleotídica de boa qualidade de 77 clones (80,2%), sendo que a biblioteca apresentou 1,3% de redundância. Destes, 73 clones (94,8%) apresentaram seqüências com SSRs.  Foi verificada a presença de 124 SSRs na biblioteca, sendo 1,7 a média do número de SSRs por clone. A maioria dos motivos de repetição foi classificada como dinucleotídeos (56,5%), sendo GT/CA o mais encontrado (42,8%), seguidos de 25% de trinucleotídeos, 11,2% de compostos, 4% de tetranucleotídeos, 3,2% de penta e hexanucleotídeos. O motivo de repetição mais freqüente (GT/CA) variou entre 6 a 19 repetições e o microssatélite com maior número de repetições encontrado foi do tipo AC com 26 repetições. Quanto à natureza de origem foram classificados em 85,5% perfeitos, 11,3% imperfeitos e 3,2% interrompidos. Foi selecionada a seqüência nucleotídica de 63 clones recombinantes (81,8%) para o desenho dos oligonucleotídeos iniciadores de PCR. Foram desenhados 69 pares de iniciadores de PCR com SSR para a referida espécie.

CONCLUSÃO:

A biblioteca genômica enriquecida apresentou alta eficiência com 94,3% de clones com microssatélites com uma média de 1,7 SSR por clone. Foram selecionados 81,8% dos clones com SSR para o desenho dos iniciadores de PCR. Um total de 69 pares de oligonucleotídeos flanqueadores de regiões microssatélites foram desenhados para a referida espécie.

Instituição de Fomento: FAPEAM/CTPETROS

Palavras-chave: Vetor da malária, Microssatélites, Biblioteca genômica.