Toxoplasma gondii, pertence ao Filo Apicomplexa, um grupo de protozoários parasitas intracelulares obrigatórios. O projeto objetiva estudar a interação de formas taquizoítas de T. gondii e Células Musculares Esqueléticas (CME) como modelo celular da toxoplasmose experimental. CME é uma das células alvo da infecção in vivo, onde ocorre a cistogênese, caracterizando a fase crônica da doença. O desenvolvimento do presente trabalho também se justifica por esse tipo celular constituir uma das principais vias de transmissão do parasito para humanos, através da ingestão de carne crua ou mal cozida. Assim, o objetivo deste trabalho é: (i) analisar a capacidade infectiva de taquizoítos de T. gondii frente à mioblastos/miócitos (células mononucleares) e miotubos (células multinucleares); (ii) verificar a interferência da infecção na miogênese; (iii) avaliar a expressão e a distribuição de proteínas do citoesqueleto durante a interação CME - bradizoítos do T. gondii.

Para obtenção de taquizoítos de T. gondii da cepa RH, camundongos suíços infectados após 72h foram isolados do peritônio e purificados por centrifugação a 200g por 7 min a temperatura ambiente. Foram empregadas técnicas de fluorescência e coloração por Giemsa para visualização dos eventos celulares decorrentes da infecção em CME. O tecido muscular foi obtido a partir das coxas de embriões de camundongos e o tecido foi dissociado enzimaticamente. Após 24h de cultivo as CME foram infectadas com taquizoítos de T. gondii na proporção 1:1 e fixadas após 24h de interação, para estudo do percentual de infecção e efeito sobre a miogênese. Parte da cultura foi fixada com Bouin para coloração em Giemsa e outra com PFA 4% em PBS para fluorescência. Para revelação de actina as CME infectadas foram incubadas com Faloidina-TRITC (4μg/mL) para observação no microscópio confocal a laser. A fusão celular foi determinada pela análise morfológica do alinhamento de miócitos e a observação do percentual de células multinucleadas. Os resultados foram baseados em experimentos independentes feitos em triplicatas com aproximadamente 100 células por lamínula.

A coloração pelo Giemsa e por fluorescência possibilitou o acompanhamento da miogênese de CME in vitro. A diferenciação de CME seguiu a seqüência organizada de eventos celulares, que se caracteriza pela fusão de miócitos e formação de miotubos multinucleados. A presença de alguns miotubos parasitados na cultura infectada provavelmente deve-se ao fato do processo de fusão ter ocorrido antes da infecção pelo T. gondii. CME-T. gondii infectada por 24h mostrou que o percentual de infecção foi de 61% e 38%, para mioblastos e miotubos, respectivamente. Demonstrou-se que miotubos foram 1.6 vezes menos infectados do que mioblastos, sugerindo que existem mudanças na capacidade do T. gondii invadirem as CME em diferentes estágios de diferenciação. Tais diferenças de infectividade podem estar relacionadas às proteínas de adesão em miotubos dificultando sua interação com o parasito através da secreção da MIC2. CME infectadas por 24h apresentaram uma inibição de 75% na miogênese. Nossos resultados demonstraram que mesmo em proporções baixas de infecção onde somente 43% (±0,02) das CME foram parasitadas, miócitos infectados não foram capazes de se fusionar, demonstrando assim, modulação negativa da miogênese pela presença do T. gondii. Análise por teste t com níveis de significância de p<0,05.

Nós discutimos, dentre outras possibilidades, que tais diferenças de infectividade possam estar relacionadas à baixa expressão de algumas proteínas de adesão em miotubos, interferindo com a interação do parasito, através da secreção da MIC2 pelos micronemas. Culturas infectadas com taquizoítos de T. gondii e analisadas após 24h de interação parasita-célula hospedeira mostraram que a formação de miotubos foi inibida em 75%, porém miócitos infectados mantiveram sua capacidade de alinhamento. Esses dados sugerem que os parasitos são capazes de interferir com a fusão de membranas entre miócitos e consequentemente afetar o processo da miogênese. Potenciais moléculas que possam estar envolvidas nesses eventos celulares estão sendo investigadas.