61ª Reunião Anual da SBPC
C. Ciências Biológicas - 8. Genética - 4. Genética Molecular
PADRONIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE AMPLIFICAÇÃO DA TÉCNICA ISSR, PARA OBTENÇÃO DE MARCADORES MOLECULARES ESPÉCIE-ESPECÍFICOS EM POPULAÇÕES DE Hypostomus DA BACIA DO RIO IVAÍ
Valéria Miranda Avanzi 1
Natascha Karoline Castro 1
Alessandra Valéria de Oliveira 1
1. CESUMAR – Centro Universitário de Maringá, Departamento de Biomedicina.
INTRODUÇÃO:
Atualmente diversas técnicas de biologia molecular têm sido utilizadas na análise genética de populações, bem como na caracterização molecular de indivíduos. A ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) tem se mostrado eficiente na produção de padrões polimórficos informativos intraespecíficos e interespecíficos, sendo útil na discriminação de espécimes. O gênero Hypostomus apresenta alta variabilidade interespecífica na morfologia e no padrão de cores, o que causa problemas de identificação taxonômica no grupo, como ocorre na bacia do rio Paraná. A correta identificação dessas espécies é pré-requisito para elaboração de estratégias de manejo e estudos de autoecologia das populações. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi padronizar as condições ideais de amplificação da técnica ISSR, utilizando DNA de espécimes de Hypostomus. Logo, a obtenção desses marcadores moleculares poderá auxiliar na discriminação de diferentes grupos.
METODOLOGIA:
Foram coletados exemplares de Hypostomus regani e Hypostomus ancistroides no rio Ivaí. Destas foram retiradas amostras de tecido muscular, que foram fixadas em álcool e estocadas em freezer. As amostras foram maceradas em nitrogênio líquido e homogeneizadas em tampão PS, tampão TH e proteinase K em banho-maria. Posteriormente, o DNA foi purificado por extração com fenol/clorofórmio (1:1) e clorofórmio, respectivamente, e precipitado com solução salina e etanol absoluto gelado. O pellet foi ressuspendido em tampão TE com RNAse. Realizou-se a quantificação através de eletroforese em gel de agarose 0,8%, por meio de comparação com DNA de fago l de concentração conhecida. A amplificação foi realizada utilizando primers com seqüências de microssatélites. Além destes também foram utilizados tampão Tris-KCl, MgCl2, dNTP, Taq-polimerase e água ultra-pura. Foram testadas diversas concentrações de DNA genômico na reação, bem como diferentes temperaturas de desnaturação, anelamento e extensão. Após a amplificação foi utilizado, para separação dos fragmentos de DNA, gel de agarose 1,4 %, corado com brometo de etídio. A visualização foi feita em um transluminador sob luz UV.
RESULTADOS:
Os primers (GGAC)3A e (GGAC)3T produziram bandas nítidas e reproduzíveis e o número de bandas nítidas geradas por primer em todos os indivíduos analisados variou de três a nove, sendo que o tamanho desses produtos amplificados permaneceu entre 350 e 2050 pares de bases (pb). A concentração ideal de DNA na reação, que possibilitou a amplificação dos fragmentos de DNA foi de 10 ng. Entretanto, a amplificação ocorreu nas temperaturas de desnaturação de 92 oC e 94 oC, nas temperaturas de anelamento de 52 oC e 55 oC e nas temperaturas de extensão de 70 oC e 72 oC. Assim, os primers testados e selecionados, para amplificação do DNA via PCR, produziram diferentes padrões de fragmentos ISSR.
CONCLUSÃO:

Foram padronizadas as condições ideais de amplificação da técnica ISSR, utilizando DNA de espécimes de Hypostomus. Os marcadores moleculares obtidos para as diferentes espécies do gênero constituirão ferramentas para a identificação de espécimes na região.

Instituição de Fomento: (PROBIC) Programa de Bolsas de Iniciação Científica do Cesumar
Palavras-chave: Hypostomus, ISSR, Marcadores Moleculares.