62ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 10. Microbiologia - 2. Microbiologia Aplicada

ANÁLISE DO PERFIL DE PROTEÍNAS DE CÉLULAS INFECTADAS COM VARIANTES MANY POLYHEDRA (MP) DO BACULOVÍRUS Anticarsia gemmatalis Multiple Nucleopolyhedrovirus

Anderson Fernandes de Brito 1 William Sihler 2 Marlinda Lobo de Souza 3

1. Universidade de Brasília - UnB 2. M.Sc., Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia 3. Dra./Orientadora, Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia

INTRODUÇÃO:

Baculovírus são vírus que podem ser utilizados como bioinseticidas, em alternativa ao uso de agrotóxicos. O vírus Anticarsia gemmatalis Multiple Nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) é usado com sucesso no manejo da lagarta-da-soja (A. gemmatalis), uma das principais pragas da cultura da soja. Os baculovírus possuem duas formas morfológicas distintas, denominadas Budded Virus (BV) e Occluded Derived Virus (ODV). Na forma ODV, os vírions apresentam-se oclusos numa matriz protéica, formando corpos de oclusão (poliedros), que são utilizados em programas de Controle Biológico. Comparada à produção de baculovírus in vivo, a produção in vitro apresenta diversas vantagens. Porém, uma grande limitação deste processo é a ocorrência de mutações genéticas que modificam os vírus, gerando os fenótipos Few Polyhedra, os quais produzem menos poliedros. Para uma eficiente produção in vitro, a seleção de variantes geneticamente estáveis e com alta produção de poliedros torna-se necessária. Tais características estão presentes em variantes denominados Many Polyhedra (MP). Em estudos anteriores, seis variantes MP do vírus AgMNPV-2D foram isolados. No presente trabalho, estes MPs foram analisados quanto ao perfil de proteínas produzidas durante a infecção em cultura de células de inseto.

METODOLOGIA:

Os variantes MPs foram isolados após sete passagens sucessivas do vírus AgMNPV-2D em células BTI-Tn5-B1-4 e selecionados pela técnica de plaque assay. Estes variantes geraram isolados denominados: MP1, MP2, MP3, MP4, MP5 e MP6. Foram utilizados inóculos destes isolados para multiplicação em frascos de 75 cm² contendo células BTI-Tn5-B1-4 em meio de cultura TNMFH acrescido de antibiótico-antimicótico, suplementado de Soro Bovino Fetal. A densidade celular adotada para as infecções era equivalente a 60% de monocamada celular. Cada um dos respectivos inóculos virais (300 µl) era adicionado às células e a adsorção ocorria em 2,5 mL de meio de cultura. Após o período de 1h, o volume final (10 mL) era restabelecido. As células foram mantidas em estufa a 27°C até 5 dias pós infecção, e então coletadas. Os efeitos citopáticos induzidos pelo vírus foram visualizados por meio de microscópio de fase (Olympus CK2). As amostras foram analisadas em gel de poliacrilamida desnaturante 15% (PAGE-SDS). Como marcador de peso molecular, foi utilizado o Full Range Rainbow RPN800E (Amersham). O gel foi fixado com metanol 40%, ácido acético 7,5% e "Coomassie" blue R-250 0,05%. A descoloração foi feita com metanol 40% e ácido acético 7,5%.

RESULTADOS:

Em análises por microscopia de contraste de fase, a partir de 48 horas pós infecção (p.i.), foram observados sintomas citopáticos típicos causados por baculovírus, tais como arredondamento celular e hipertrofia nuclear, assim como a formação de poliedros. No 5º dia p.i., foi observado 100% de infecção das células. A análise por PAGE-SDS revelou similaridade entre os perfis de proteínas das células infectadas com os variantes MPs. Em comparação com células não infectadas (mock infected), foi observada a presença de uma banda de cerca de 30 KDa, no clone AgMNPV-2D e nos seis variantes MPs. Este resultado era esperado, pois esta banda corresponde a poliedrina, o principal componente protéico do poliedro. Por possuir um promotor forte, o gene polh expressa a poliedrina em grande quantidade no final do ciclo de replicação viral, representando cerca de 90% da matriz protéica do poliedro. Outras proteínas virais foram expressas, no entanto, devido à abundância de proteínas estruturais das células, não foi possível identificá-las por PAGE-SDS. Trabalhos para avaliação da estabilidade genética dos seis variantes MPs do vírus AgMNPV, com base no perfil de restrição do DNA viral, encontram-se em andamento.

CONCLUSÃO:

Em função de sua alta especificidade, os baculovírus mostram-se bastante promissores para o manejo racional de pragas de agrossistemas, sem, no entanto, causar prejuízos ao meio ambiente e aos seus aplicadores no campo. Apesar de diversas vantagens na produção de baculovírus em sistema in vitro, existe uma grande limitação decorrente do fato de mutações serem geradas durante passagem serial do vírus em cultivos celulares, levando a baixa formação de poliedros e conseqüente redução da virulência. Estudos que envolvam a seleção e caracterização de variantes Many Polyhedra são importantes, pois a obtenção destes variantes geneticamente estáveis poderá resultar na otimização do processo de produção in vitro. Os variantes Many Polyhedra do vírus AgMNPV, analisados neste trabalho, deverão ser utilizados como estratégia no processo de produção do vírus em larga escala em cultivos celulares.

Instituição de Fomento: Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia

Palavras-chave: Baculovírus, Many Polyhedra, Anticarsia gemmatalis.