62ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 1. Biologia Molecular

EXPRESSÃO DE ENZIMAS CELULOLÍTICAS NA PAREDE CELULAR DE Saccharomyces cerevisiae

Beatriz Chiyin Ma 1 Lídia Maria Pepe de Moraes 2

1. Depto.Biologia Celular, Inst.de Ciências Biológicas,Universidade de Brasília/UnB 2. Profa.Dra./Orientadora - Depto.Biologia Celular, Inst.de Ciências Biológicas/UnB

INTRODUÇÃO:

O Brasil gera toneladas de bagaço de cana-de-açúcar anualmente. Um dos principais componentes do material lignocelulósico do bagaço é a celulose. A levedura Saccharomyces cerevisiae é o principal microorganismo gerador de etanol no Brasil, mas ela é incapaz de utilizar a celulose para a produção de etanol. Para que a levedura possa aproveitar a celulose, esta deve ser reduzida a glicose pela ação das enzimas endoglicanase, exoglicanase e beta-glicosidase. O objetivo deste trabalho consiste na geração de linhagens recombinantes de S.cerevisiae para a produção de etanol via fusão dos genes egl2 e cbh1.2 de Humicola grisea com a alfa-aglutinina de S.cerevisiae, uma proteína de parede celular envolvida na adesão celular durante o acasalamento. Esta construção permitirá a expressão das proteínas de interesse na parede celular da levedura e o desenvolvimento de reatores de conversão de celulose a glicose com as enzimas aderidas à parede celular e às leveduras imobilizadas.

METODOLOGIA:

Oligonucleotídeos específicos foram desenhados para a amplificação dos genes de interesse de modo a fusioná-los ao fragmento de DNA correspondente à região C-terminal da alfa-aglutinina de S.cerevisiae. Os genes da egl2 e da cbh1.2 foram amplificados por técnicas de PCR, inseridos em vetor de clonagem (pGEM-T) e transformados em células de Escherichia coli, utilizando protocolo específico. Colônias contendo o inserto desejado foram selecionadas, seus plasmídeos extraídos e os genes purificados. O passo seguinte consiste na fusão dos genes de interesse ao vetor pIJα, previamente construído, contendo a região C-terminal da âncora de GPI do gene da alfa-aglutinina, fase ainda não concluída. Em uma próxima etapa, as enzimas fusionadas serão clonadas no vetor YEP351:PGK e os plasmídeos resultantes serão utilizados na transformação da linhagem MFL de S.cerevisiae. Os transformantes serão analisados quanto à capacidade de produção enzimática e de crescimento em substratos específicos.

RESULTADOS:

O desenho dos oligonucleotídeos foram analisados e comparados às sequências dos genes de interesse utilizando o programa BLAST. As amplificações dos genes da egl2 e cbh1.2 foram confirmadas por meio de análise em gel de agarose utilizando marcador λBstBII, correspondendo aos tamanhos esperados de 1,353kb (cbh1.2) e 1,167kb (egl2). Dificuldades foram encontradas em relação à fusão dos genes de interesse ao vetor de clonagem pGEM-T. Sugere-se que uma possível degradação do ATP e algum fator no kit de purificação dos genes de interesse estejam impedido a etapa de ligação dos insertos desejados ao vetor. A mudança do kit de purificação e a adição de ATP na fase de ligação foram feitas na tentativa de solucionar o problema. A etapa de fusão dos genes de interesse ao vetor pIJα ainda não foi concluída.

CONCLUSÃO:

O preparo de amostras para a fusão de genes de interesse a regiões específicas nos vetores passa por diversas etapas que são sensíveis a qualquer alteração realizada. Desde as reações de amplificação por PCR, passando pela purificação final e à ligação do inserto ao vetor, modificações sensíveis em seus parâmetros são determinantes no sucesso ou no fracasso da etapa seguinte. O passo seguinte nesse estudo consiste na modificação de parâmetros na tentativa de obtenção de resultados mais promissores na fusão dos genes de interesse ao gene da alfa-aglutinina e de superação dos obstáculos atuais. Assim, espera-se que este trabalho possa alcançar ao objetivo final, que consiste no sucesso no aproveitamento da celulose como fonte de carbono para a produção de etanol.

Instituição de Fomento: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq

Palavras-chave: Saccharomyces cerevisiae, alfa-aglutinina, enzimas celulolíticas.