62ª Reunião Anual da SBPC
C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 3. Enzimologia
IDENTIFICAÇAO E PURIFICAÇÃO PARCIAL DE UMA GLICOSIDASE ISOLADA DO MOLUSCO Thais haemastoma
Paulo Leonardo Araújo de Góis Morais 1
João Paulo Matos Santos Lima 1, 3
João Felipe de Sousa Filho 1, 2
1. Universidade Federal do Rio Grande do Norte / UFRN
2. Prof. Dr. - Orientador
3. Prof.
INTRODUÇÃO:
Os Glicosaminoglicanos sulfatados (GAGS) são heteropolissacarídeos amplamente distribuídos no reino animal, são constituídos por unidades dissacarídicas repetitivas contendo uma hexosamina (glucosamina ou galactosamina) e um açúcar não nitrogenado: ácido urônico (ácido-D-glucorônico ou ácido-L-idurônico) ou galactose, unidos por ligação glicosídica . Existem seis tipos principais de GAGS encontrados em tecidos animais: condroitim 4-sulfato, condroitim 6-sulfato, dermatan sulfato, heparam sulfato, ácido hialurônico e heparina. Existe uma grande heterogeneidade entre os glicosaminoglicanos, seja no grau de sulfatação, nas proporções das unidades dissacarídicas ou no tamanho molecular das cadeias (LIRA FILHO, B. A. et al., 2007). Existe para cada tipo de GAGs, glicosidases específicas, e elas podem ser : 1) Endoglicosidases - atua sobre o polissacarídeo transformando-o em oligos; 2) Exoglicosidases - atua sobre os oligos a partir da extremidade não redutora de maneira seqüencial e de acordo com a sua especificidade, onde os Condroitins 4 e 6 - sulfatos são degradados pela ação de uma endo e duas glicosidases e sulfatases. Na literatura são poucas as referências sobre glicosidases em invertebrados, e as que tem, mostram a atividade destas enzimas sobre substratos sintéticos.
METODOLOGIA:
Para obtenção do extrato protéico, 100g de tecido do molusco Thais haemastoma foram homogeneizados com 2 volumes de tampão acetato de sódio 0,1M, pH 5,0, um processo de disrupção celular. Após a remoção dos restos celulares por centrifugação, o sobrenadante foi fracionado com sulfato de amônio em concentrações crescentes 0-50% e 50-80%. Logo após foram realizadas as centrifugações, os precipitados foram recolhidos, denominados F1 e F2 respectivamente e ressuspensos no mesmo tampão. Concentrações crescentes das frações foram incubadas com 10μg de condroitim sulfato (CS) a 37ºC por 16h. As reações enzimáticas foram interrompidas e então submetidas a eletroforese em gel de agarose 0,6% em tampão PDA, sendo a partir de então visualizadas as atividades glicosidásicas, através do desaparecimento metacromático. A fração F1 apresentou uma maior atividade, e por isso foi cromatografada em gel filtração Bio-Gel A 1,5m, eluída em tampão acetato de sódio 0,1M, pH 5,0. Depois disso, as frações foram divididas em 3 "pools" de atividades, onde foram incubadas com substratos sintéticos: β-glucuronídeo, -Nac-glucosaminídeo, β-Nac galactosamina, -D-glucopiranosídeo e sulfatase.
RESULTADOS:
Foi constatado, após a análise dos resultados obtidos da cromatografia em gel filtração, picos de atividades em determinadas frações, que foram divididas em 3 "pools". Os 3 "pools" foram submetidos a nova incubação com os substratos sintéticos citados na metodologia. Constatou-se que o "pool 2" apresentou forte atividade β-Glucuronidásica, ratificada com uma nova incubação dos substratos, sugerindo um certo grau de purificação. O aparecimento da β-Glucuronidase nas frações iniciais / intermediárias, sugere que, provavelmente trata-se de uma enzima de peso molecular relativamente baixo.
CONCLUSÃO:
Os resultados obtidos ate o momento sugerem que o molusco possui várias enzimas envolvidas no metabolismo de Glicosaminoglicanos sulfatados. Um certo Grau de purificação foi atingido, possibilitando-nos partir para uma caracterização mais minuciosa da β-Glucuronidase. Um SDS-PAGE (eletroforese em gel de Poliacrilamida em presença de SDS) dirá o grau de purificação da enzima parcialmente purificada.
Instituição de Fomento: Propesq / IC - Pró-reitoria de Pesquisa / Iniciação Científica - UFRN
Palavras-chave: Proteoglicanos, Thais haemastoma, β-glucuronidase.