62ª Reunião Anual da SBPC
C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 6. Bioquímica
PURIFICAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E ATIVAÇÃO DE MACRÓFAGOS in vitro DA LECTINA DO FUNGO Clavaria cristata
Dayse Caroline Severiano da Cunha 1
Jannison Karlly Cavalcanti Ribeiro 1
Phelippe Emmanuel de Lima Nascimento de Melo 1
Adriana Ferreira Uchôa 2
Elizeu Antunes dos Santos 1
Maurício Pereira de Sales 1
1. Depto. Bioquímica, Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
2. Depto. Biologia Molecular e Genética - UFRN
INTRODUÇÃO:

Lectinas são proteínas que reconhecem e se associam de forma reversível, com alta afinidade e especificidade, a carboidratos sem, contudo, apresentarem atividade enzimática. Estas proteínas apresentam uma diversidade de atividades biológicas importantes, dentre elas, destacam-se antimicrobiana, anticâncer, imunomoduladora e inseticida. A grande diversidade de lectinas presentes nos fungos intensifica o interesse pela descoberta dessas moléculas em novas espécies de fungos. A espécie Clavaria cristata, objeto de estudo deste trabalho, é encontrada em florestas tropicais, onde são importantes na reciclagem da matéria orgânica vegetal. Com o intuito de ampliar o conhecimento da diversidade de lectinas presentes no Reino Fungi com propriedades biológicas importantes, a presença de lectinas foi investigada no fungo C. cristata, no qual uma lectina foi purificada e sua atividade na indução da produção de óxido nítrico via ativação de macrófagos foi investigada. Esta atividade é alvo de prospecção e estudo, pois o óxido nítrico em tecidos animais pode estar envolvido nos efeitos anti-tumoral e anti-parasitismo desencadeado por estas moléculas.

METODOLOGIA:

Os fungos da espécie C. cristata foram coletados no Parque Estadual Dunas, localizado em Natal-RN.Também foram utilizados como materiais, eritrócitos humanos obtidos através de doações de bolsas de sangue pelo HEMOCENTRO - RN e camundongos que foram fornecidos pelo Biotério da UFRN. O trabalho teve como metodologia, a extração protéica do fungo, ensaios de hemaglutinação e ensaios de inibição da hemaglutinação para verificar a atividade lectínica do extrato bruto. Em seguida, o extrato bruto foi submetido a uma cromatografia em gel filtração S200 e o pico protéico com atividade lectínica foi reunido e aplicado em uma cromatografia de troca aniônica Resource Q, obtendo assim, a lectina purificada e denominada CcL. A CcL foi caracterizada quanto a sua massa molecular através de SDS-PAGE, sua especificidade de ligação com diferentes tipos sanguíneos e glicoproteínas através de ensaios de hemaglutinação e inibição da hemaglutinação. O efeito da temperatura e do pH sobre sua atividade hemaglutinante e dependência por íons bivalentes foram também avaliados. CcL foi avaliada quanto à ativação de macrófagos in vitro, através da indução e produção de óxido nítrico em cultura de macrófagos.

RESULTADOS:
Os ensaios de hemaglutinação com o extrato bruto (EB) do fungo foram realizados com eritrócitos humanos submetidos a tratamentos enzimáticos com papaína e tripsina na presença de íons bivalentes. A maior atividade hemaglutinante (AH) foi com sangue tipo O na presença de cálcio e tratado com tripsina. Nos ensaios de inibição da hemaglutinação, apenas as glicoproteínas reduziram a AH. O EB submetido à cromatografia em gel filtração apresentou apenas um pico protéico com atividade lectínica, este foi reunido e aplicado em uma cromatografia de troca aniônica Resouce Q, obtendo-se a lectina purificada. A CcL purificada apresenta uma única banda protéica, com massa molecular de aproximadamente 66,2 kDa em SDS-PAGE. Na curva de termoestabilidade da lectina, ela apresentou-se estável até a temperatura de 80 oC. Quanto ao efeito do pH, observou-se uma atividade constante independentemente do pH. Em relação a produção de óxido nítrico in vivo, os resultados indicaram que CcL na concentração de 100 μg/mL e 50μg/mL apresentou aumento significativo de nitrito/nitrato em relação ao controle negativo indicando a ativação de macrófagos.
CONCLUSÃO:
Uma lectina foi purificada do fungo C. cristata apresentando atividade hemaglutinante preferencial para os eritrócitos do tipo O, submetidos ao tratamento com tripsina, dependente da presença de íons cálcio. A atividade hemaglutinante de CcL foi fortemente inibida pela glicoproteína BSM até a concentração mínima de 0,156 mg/mL. A massa molecular da lectina, determinada por eletroforese em gel de poliacrilamida foi de 66,2 kDa. A atividade hemaglutinante da lectina foi estável até 80ºC e na faixa pH de 2,5 a 11,5. A CcL foi capaz de induzir a ativação de macrófagos com conseqüente liberação de óxido nítrico.
Instituição de Fomento: CAPES, CNPq, PIBIC.
Palavras-chave: Lectina, Macrófagos, Óxido nítrico.