62ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 8. Genética - 4. Genética Molecular

EFEITOS CITOTÓXICOS INDUZIDOS PELA RIBOFLAVINA FOTOSSESIBILIZADA EM CÉLULAS HUMANAS PROFICIENTES E DEFICIENTES EM REPARO DE DNA

Julliane Tamara Araújo de Melo 1 Juliana Alves Brandão 1 Acarízia Eduardo da Silva 1 Ana Rafaela de Souza Timoteo 1 Tirzah Braz Petta Lajus 2 Lucymara Fassarella Agnez-Lima 1

1. Departamento de Biologia Celular e Genética, Centro de Biociências - UFRN 2. Liga Norte Rio Grandense Contra o Câncer - LNRCC, Natal

INTRODUÇÃO:

A riboflavina é uma vitamina de fundamental importância em organismos aeróbios, sendo precursora de importantes coenzimas que participam da cadeia transportadora de elétrons. Contudo, após a sensibilização da riboflavina com luz UV ou luz visível, observou-se a formação de espécies reativas de oxigênio (EROs), as quais podem oxidar o DNA. O reparo de lesões oxidativas no DNA ocorre principalmente através da via de reparo por excisão de bases (BER), onde a endonuclease APE1 atua no reparo dessas lesões. Por sua vez, a via de reparo por excisão de nucleotídeos (NER) atua reparando lesões no DNA causadas pela luz UV. Em seres humanos, a descoberta de que pacientes com Xeroderma Pigmentoso e Síndrome de Cockayne apresentam deficiência na via NER foi a primeira indicação da importância dessa via para a manutenção da estabilidade genômica. Recentemente tem sido descrito a participação da via NER na remoção de danos oxidativos e na estimulação da função de reparo de APE1, indicando o papel do estresse oxidativo no desenvolvimento das referidas doenças. Desta forma, o objetivo desta pesquisa foi analisar os efeitos citotóxicos da riboflavina fotossensibilizada (RF*) em células proficientes e deficientes na via NER, correlacionando à expressão e à regulação de APE1.

METODOLOGIA:

No presente trabalho foram utilizadas as seguintes linhagens celulares: MRC5-SV, proficiente na via NER; XP12RO, deficiente na proteína XPA da via NER; XP4PA, deficiente na proteína XPC da via NER; e CS1AN, deficiente na proteína CSB da via NER. Para a determinação do potencial citotóxico da riboflavina fotossensibilizada (RF*), foi realizado o ensaio de exclusão do azul de trypan. Essa técnica baseia-se no fato de que células viáveis não incorporam o referido corante, uma vez que possuem a membrana plasmática íntegra. Já as células mortas incorporam o corante, uma vez que a membrana plasmática dessas células está danificada. A contagem das células viáveis e não viáveis foi realizada utilizando-se câmara de Neubauer e microscopia óptica. A viabilidade das linhagens proficientes e deficientes em reparo de DNA, após tratamento com riboflavina fotossensibilizada, foi determinada com base no controle positivo. As análises da expressão de APE1 foram realizadas utilizando-se a técnica de immunoblotting. Após o tratamento das linhagens celulares com RF*, foi realizada a extração de proteínas totais e o fracionamento celular. As análises da expressão de APE1 bem como de outras proteínas envolvidas no reparo de DNA foi evidenciada.

RESULTADOS:

Os resultados evidenciaram perfis de sensibilidade distintos ao estresse oxidativo induzido pela RF*, onde as linhagens XPA e CSB foram mais sensíveis, enquanto a linhagem XPC mostrou resistência similar à linhagem MRC5, a qual é proficiente na via NER. Esses resultados indicam que as proteínas XPA e CSB possuem um importante papel no reparo das lesões oxidativas induzidas pela RF*. Em relação às análises dos níveis de expressão de APE1, os resultados evidenciaram que não houve alteração na expressão dessa proteína após o tratamento com RF*. Porém, observamos que APE1 é recrutada e se torna fortemente ligada à cromatina após o tratamento nas linhagens MRC5 e XPA, indicando que essa proteína pode estar envolvida reparo das lesões causadas pela RF*. Nós comprovamos a indução de danos após o tratamento com RF* através do estudo da proteína γ-H2AX, pois o tratamento provocou um aumento nos níveis endógenos desta proteína fosforilada, a qual atua com um sensor de quebras de fita dupla no DNA. Porém, na linhagem XPC, além de termos observado uma curva de sobrevivência semelhante à linhagem MRC5, observamos que os níveis endógenos de APE1 são amplamente reduzidos quando comparados com as outras linhagens. Este resultado é inédito e está sendo atualmente estudado em nosso laboratório.

CONCLUSÃO:

Conclui-se que a riboflavina fotossensibilizada foi capaz de induzir a morte celular em linhagens deficientes no sistema de reparo por excisão de nucleotídeos. Nós observamos que as linhagens XPA e CSB foram mais sensíveis quando comparadas à linhagem normal MRC5 e também à linhagem XPC. Este último resultado é potencialmente interessante, considerando que a linhagem XPC apresenta baixos níveis protéicos de APE1. Nós estamos atualmente estudando este mecanismo. Adicionalmente, os resultados evidenciaram que a proteína APE1 pode estar envolvida no reparo de danos oxidativos causados pela RF*, já que APE1 é recrutada na cromatina e se liga fortemente a esta após o tratamento.

Instituição de Fomento: FAPERN, CNPq e Rede Redoxoma - Processos Redox em Biomedicina

Palavras-chave: Riboflavina, APE1, NER.