62ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 3. Enzimologia

EXTRAÇÃO DE UMA N-ACETIL-β-D-GLUCOSAMINIDASE PRESENTE NO CEFALOTÓRAX DO CAMARÃO MARINHO Litopenaeus schmitti E SUA IMOBILIZAÇÃO EM DACRON FERROMAGNÉTICO

Themis Taynah da Silva Santana ¹
Roberta Luciana Do Nascimento Godone ¹
Luiz Roberto Diz De Abreu ¹
Luiz Bezerra De Carvalho Júnior ²
Luciana Duarte Martins Da Matta ¹

1. Universidade Federal do Rio Grande Do Norte - UFRN
2. Universidade Federal de Pernambuco - UFPE

INTRODUÇÃO:

Quitinases são enzimas envolvidas na degradação da quitina, um polímero linear formado por dissacarídeos de N-acetil-D-glucosamina unidas por ligação glicosídica b- 1,4. A quitina é encontrada em insetos, crustáceos e fungos, sendo hidrolisada por Endo-quitinases, Exo-quitinases e b-N-acetilhexosaminidases. A identificação e purificação dessas enzimas se prestam à necessidade de caracterizar quimicamente estes compostos, produzir oligossacarídeos modificados com a intenção de estudar as interações de determinadas regiões destas moléculas e possíveis funções farmacológicas. O Dacron (polietilenotereftalato), também conhecido como PET e amplamente usado na fabricação de recipientes plásticos, é aqui proposto como suporte para a imobilização de uma N-acetil-β-D-glucosaminidase (NAG) obtida de uma porção normalmente descartada do camarão marinho Litopenaeus Schmitti, o cefalotórax. Materiais magnéticos como o Dacron têm sido usados como matrizes devido à sua facilidade de remoção do meio reacional com auxílio de um campo magnético. O objetivo do trabalho consistiu em purificar parcialmente a NAG, imobilizar em PET e realizar testes cinéticos comparando-os com aqueles já determinados para a enzima solúvel. Desta maneira propõe-se uma forma de reciclagem para os recipientes PET.

METODOLOGIA:

Os cefalotórax foram homogeneizados em tampão acetato de sódio 0,1 M pH 5,0, centrifugados e o sobrenadante foi submetido a fracionamento com sulfato de amônio em três etapas de saturação: 0-30% (F-I), 30-50% (F-II) e 50-80% (F-III). A fração F-III foi submetida à cromatografia de troca-iônica DEAE-biogel. O perfil de eluição foi determinado por absorção a 280 nm. Para a determinação das atividades enzimáticas, alíquotas destas frações foram ensaiadas a 37°C durante 30 min com PNF-N-acetil-β-D-glucosaminídeo como substrato. As frações com maior atividade N-acetilglucosaminidásica foram reunidas em pool para imobilização. O Dacron ferromagnético foi ativado com Glutaraldeído a 2,5% por 2h sob agitação constante. No processo de imobilização, cada 10 mg de Dacron foi incubado com 1 mL da enzima (16h) sob agitação. 1 mL de glicina 1M foi adicionado à enzima imobilizada (2h) para bloquear possíveis sítios livres do glutaraldeído. Obtido o derivado insolúvel NAG-Dacron ferromagnético, este foi submetido a ensaios cinéticos utilizando-se o substrato acima citado. Foi avaliado: estabilidade de estoque e de ligação ao suporte, estabilidade operacional, temperatura ideal, estabilidade térmica, influência do pH e determinação do K_m. Os ensaios foram realizados em duplicata.

RESULTADOS:

A fração F-III, por ser mais rica na atividade N-acetil-β-D-glucosaminidásica, foi submetida à cromatografia DEAE-Biogel, eluindo-se um pico protéico na fração 0,2 M de NaCl. Em seguida, foi covalentemente imobilizada no suporte, rendendo um derivado insolúvel ativo (NAG-Dacron ferromagnético) contendo 3,09 unid/mg de proteína e retendo 13,47% da atividade da enzima solúvel. Os estudos cinéticos mostraram temperatura ótima de reação entre 45 e 55°C (imobilizada) e de 55°C (solúvel); geralmente, as enzimas imobilizadas apresentam maior resistência ao aquecimento. A NAG imobilizada mostrou estabilidade térmica maior, potencializando sua atividade a 60°; a ativação em temperatura mais alta pode ser devido à redução na flexibilidade da molécula ocasionada pelas ligações ao suporte, necessitando de uma maior energia de ativação para reorganizar a sua conformação para ligação ao substrato (BAYRAMOĞLU et al., 2009). Diferentemente da NAG solúvel, cuja atividade ótima foi entre pH 5,0-6,0, a NAG imobilizada revelou maior estabilidade em pHs mais ácidos, 3,0-5,0. Valores de K_mforam calculados em 0,51 e9,9 mM para a enzima solúvel e imobilizada, respectivamente. A NAG imobilizada exibiu maior estabilidade de estoque e pôde ser reutilizada por 12 vezes seguidas sem perda de atividade.

CONCLUSÃO:

A fração F-III (50-80%) apresentou maior atividade da enzima N-acetil-β-D-glucosaminidase, a qual foi escolhida como alvo para pré-purificação. Após as etapas de purificação foi possível observar grau de purificação na ordem de 2,12 vezes com recuperação de 2,38% da enzima N-acetil-β-D-glucosaminidase. A NAG, quando covalentemente imobilizada em partículas magnéticas (Dacron), resultou em um derivado insolúvel detentor das seguintes propriedades: facilmente removível do meio reacional através de um campo magnético; retenção de 13,47% da atividade específica da enzima solúvel; reutilizações seguidas sem perda de atividade; maior estabilidade de estoque do que a enzima solúvel; retenção de atividade após meses de armazenamento a 4°C em solução tampão; faixa de temperatura ótima entre 45 e 55°C; mais termoestável que a enzima solúvel; maior estabilidade em pHs ácidos, divergindo da forma solúvel que possui melhor atuação numa faixa de pH entre 5,0 e 6,0 e constante de Michaelis-Menten (K_m) maior em comparação à forma solúvel indicando que a enzima quando imobilizada tem menor afinidade pelo substrato. Por fim, a enzima se manteve firmemente aderida ao suporte e a excelente estabilidade de estoque e reutilização demonstra o potencial do sistema enzima-Dacron para aplicações práticas.

Instituição de Fomento: UFRN / CNPq / FAPERN

Palavras-chave: N-acetil-β-D-glucosaminidase, Imobilização, Dacron Ferromagnético.