62ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 1. Biologia Molecular

ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE α-GLICOSIDASES RECOMBINANTES EM SISTEMA CELULAR Sf9

Maria da Conceição Mendes Ferreira da Costa ¹
Tatiany Patrícia Romão Pompílio de Melo ²
Lígia Maria Ferreira ²
Maria Helena Neves Lobo Silva Filha ³

1. Iniciação Científica do Depto. de Entomologia-Centro de Pesquisa Aggeu Magalhães
2. Doutoranda em Saúde Pública - Centro de Pesquisa Aggeu Magalhães
3. Dra./Orientadora - Centro de Pesquisa Aggeu Magalhães

INTRODUÇÃO:

O Bacillus sphaericus é uma bactéria que tem uma importante aplicação biotecnológica, pois produz cristais que contém uma proteína inseticida, a toxina Binária (Bin), para larvas de culicídeos de importância médica. A ação letal da toxina Bin nas larvas depende da sua ingestão e ligação a receptores específicos no epitélio intestinal. Em Culex quinquefasciatus o receptor é uma α-glicosidase de membrana de 60 kDa, denominada Cqm1. Em larvas de Aedes aegypti não ocorre ligação da toxina ao epitélio intestinal das larvas, entretanto, uma α-glicosidase com 80% de similaridade à Cqm1 está presente no intestino das larvas. Para avaliar as características que determinam a capacidade de interação da proteína Cqm1 com a toxina Bin, bem como a refratariedade do Aedes aegypti é necessária a produção sob a forma recombinante. O objetivo geral do projeto é produzir as α-glicosidases Cqm1 e Aam1 em sistema heterólogo de expressão em linhagem celular SF9 oriundo do lepidóptero Spodoptera frugiperda e avaliar a sua expressão.

METODOLOGIA:

Inicialmente, os genes cqm1 e aam1 foram clonados no vetor pGEM T-easy® (Promega) para, em seguida, serem subclonados no vetor de expressão pIZT® (Invitrogen). Após o término desta etapa, foram obtidos construtos contendo os insertos correspondentes a fragmentos gênicos, de cerca de 1650 pares de bases, que codificam as proteínas Cqm1 e Aam1 solúveis (Cqm1-S, Aam1-S). Os plasmídeos contendo os respectivos genes foram utilizados em procedimentos de transfecção das células Sf9, segundo protocolo do fabricante (Invitrogen). As células transfectadas foram submetidas à seleção com o antibiótico ZeocinaT (Invitrogen) em meio Sf-900 II SFM (sem soro fetal bovino), após 48h da transfecção. A análise da expressão protéica foi realizada através da precipitação das proteínas solúveis, presentes no meio, pela a ação do ácido tricloroacético e posterior imunodetecção com anticorpo anti-Cqm1, o qual foi produzido previamente contra a proteína Cqm1.

RESULTADOS:

As respectivas subclonagens foram realizadas com sucesso e foram obtidas as duas construções plasmidiais. As transfecções das células Sf9, com as construções pIZT-cqm1-S e pIZT-aam1-S, obtiveram cerca de 60% de eficiência. A análise dos meios de cultivo das células transfectadas, coletados cerca de 15 dias após o início da seleção, indica que as células Sf9 estão expressando as proteínas de interesse. A imunodetecção revelou proteínas com peso molecular semelhante às α-glicosidases Cqm1 e Aam1 nativas.

CONCLUSÃO:

Esses dados indicam que as proteínas Cqm1 e Aam1 estão sendo expressas em quantidades detectáveis nas células Sf9, o que indica que esse sistema de expressão é adequado.

Instituição de Fomento: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq

Palavras-chave: Receptor, Culex quinquefasciatus, Sistema de expressão Sf9.