62ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 5. Química de Macromoléculas

ARABINANA E GALACTANA SULFATADAS COM ATIVIDADE ANTICOAGULANTE EXTRAÍDAS DA ALGA VERDE Codium isthmocladum

Diego de Araujo Sabry 1 Sara Lima Cordeiro 1 Nednaldo Dantas dos Santos 1 Guilherme Lanzi Sassaki 2 Helena Bonciani Nader 3 Hugo Alexandre de Oliveira Rocha 1

1. Depto. Bioquímica, Universidade Federal do Rio Grande do Norte-UFRN 2. Depto. Bioquímica, Universidade Federal do Paraná-UFPR 3. Disciplina de Biologia Molecular, Universidade Federal de São Paulo-UNIFESP

INTRODUÇÃO:

Apesar de algumas desvantagens, heparina, um polissacarídeo altamente sulfatado presente em tecidos de muitos mamíferos, é usado como um anticoagulante sanguíneo em laboratórios e na terapêutica. As desvantagens associadas à heparina abriram uma frente de pesquisas para se descobrir novas substâncias com atividade anticoagulante. Existem semelhanças estruturais entre polissacarídeos sulfatados (PS) sintetizados por algas marinhas e a heparina. A atividade anticoagulante de PS de algas marinhas foi primeiramente relatada em 1936 e o avanço dos estudos com estas moléculas vem demonstrado à existência de PS com atividade anticoagulante, fibrinolítica, antitrombótica e de inibidor da agregação de plaquetas. Contudo, os PS de algas verdes em relação a aqueles das algas vermelhas e marrons são muito pouco estudados neste sentido, algo não justificável, pois estas algas também sintetizam PS anticoagulantes. De todos gêneros de algas verdes aquele que apresenta mais espécies estudadas com relação a presença de polissacarídeos anticoagulantes e o gênero Codium. Em geral estas algas sintetizam homo e heteropolímeros sulfatados ricos em galactose, arabinose, manose /ou glicose. A alga Codium isthmocladum, comum no litoral do Rio Grande do Norte, sintetiza polissacarídeos sulfatados. Contudo estes ainda não foram estudadas como anticoagulantes. Assim, o principal objetivo deste trabalho foi purificar e caracterizar quimicamente polissacarídeos sulfatados da alga Codium isthmocladum e avaliar suas atividades anticoagulantes.

METODOLOGIA:

O extrato total dos polissacarídeos da alga verde Codium isthmocladum foi extraído através de digestão proteolítica, e então fracionados por precipitação sequencial com acetona, obtendo-se, assim cinco frações cetônicas. As frações cetônicas foram submetidas aos testes de atividade anticoagulante bem como à análise de composição monossacarídica, as frações com melhor desempenho anticoagulante, denominada de F0,5V, foi selecionada para dar continuidade à purificação. Ela foi submetida à cromatografia líquida de troca-iônica (DEAE Sepharose) em sistema de Äkta Purifier e o material foi eluído em gradiente contínuo (NaCl 0,25M até 3,0M) e o monitoramento da eluição foi feito por dosagem de açúcares totais e detecção de sulfato por DMB. Obteve-se assim cinco frações. A presença de PS nestas frações foi determinada por eletroforese em gel agarose (tampão PDA 0,05M pH 9,0) e sua atividade e sua atividade anticoagulante in vitro foi analisada através de kit de aPTT e sua composição monossacarídica foi determinada por cromatografia gasosa.

RESULTADOS:

Foram obtidas cinco frações cetônicas (F0,3V; F0,5V; F0,7V; F0,9V e F1,2V) do fracionamento com acetona do extrato total de polissacarídeos de Codium isthmocladum. Ensaios mostraram que todas as frações apresentam atividade anticoagulante. Porém, dentre elas a fração F0,5V apresentou uma alta atividade anticoagulante, aumentando o tempo normal de coagulação de 35,9 s para 164,3 s. A cromatografia de troca-iônica fracionou F0,5V em cinco frações (DP1, DP2, DP3, DP4, DP5). Após submissão destas frações a eletroforese em gel de agarose verificou-se que que DP1 e DP4 não eram compostas de polissacarídeos sulfatados e que DP2 apresentou uma coloração indicativa da presença de altas quantidades de contaminação protéica. Por outro lado, DP3, DP5 e DP6 apresentaram coloração indicativa da presença de polissacarídeos sulfatados. DP6 apresentou um rendimento insuficiente para a realização de testes posteriores e portantanto não foi analizada. DP3 e DP5 foram acetiladas e a análise de sua composição monossacarídica revelou que DP5 é uma galactana sulfatada e DP3 é uma arabinana sulfatada. A avaliação da atividade anticoagulante desses polissacarídeos mostrou que DP5 dobrou o tempo normal de coagulação com 20 ug, já DP3 dobrou o tempo normal de coagulação com 10 ug.

CONCLUSÃO:

As análises demonstraram que Codium isthmocladum, como outras espécies deste gênero, sintetiza polissacarídeos sulfatados constituídos de arabinose ou galactose. Contudo a presença destes monossacarídeos foi detectada em varias frações cetônicas, o que indica que a alga sintetiza não um só tipo de polissacarídeo formado por galactose ou arabinose, mas sim uma família constituída de galatanas sulfatadas e outra família constituída de arabinanas sulfatadas. Com a metodologia utilizada conseguiu-se purificar uma galactana sulfatada e uma arabinana sulfatada, um representante de cada família, que apresentam alta atividade anticoagulante. Análises futuras tanto in vitro como in vivo determinarão o potencial destes polissacarídeos como futuros fármacos anticoagulantes.

Instituição de Fomento: CNPq, MCT, CAPES e Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas - UFRN

Palavras-chave: homoarabinana sulfatada, aPTT, polissacarídeos sulfatados.