62ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 5. Química de Macromoléculas

CARACTERIZAÇÃO DA ATIVIDADE INIBIDORA DE PROTEASE DE UM PEPTÍDEO ISOLADO DO ESCORPIÃO Tityus cambridgei

Caroline Barbosa Farias Mourão 1 Carlos Bloch Junior 2 Maura Vianna Prates 2 Elisabeth Nogueira Ferroni Schwartz 1

1. Laboratório de Toxinologia, Departamento de Ciências Fisiológicas, UnB 2. Laboratório de Espectrometria de Massa, EMBRAPA Cenargen

INTRODUÇÃO:

A peçonha de escorpiões possui uma grande variedade de moléculas bioativas. As frações tóxicas geralmente afetam canais iônicos de membranas de células excitáveis e não-excitáveis (Batista et al., 2004). Análises da peçonha do escorpião Tityus cambridgei (Buthidae) mostraram a existência de no mínimo 102 componentes distintos, estando menos de 25% com sua seqüência N-terminal determinada e seis completamente seqüenciados (Batista et al., 2004; Murgia et al., 2004). A partir de dados obtidos do banco de cDNA da glândula de peçonha do T. cambridgei, pudemos identificar na glândula de peçonha desse escorpião o precursor de um peptídeo com provável atividade inibidora de protease (PI) do tipo Kunitz (dado não publicado). O interesse na identificação de novos PIs tem aumentado recentemente devido ao seu potencial uso no tratamento de algumas patologias humanas e no desenvolvimento de plantas mais resistentes a pragas (Lingaraju & Gowda, 2008). Neste trabalho foi realizada uma busca, na peçonha do escorpião T. cambridgei, pelo peptídeo com possível atividade inibidora de protease (TcamPI).

METODOLOGIA:

A peçonha de Tityus cambridgei foi obtida por estimulação elétrica do télson e imediatamente liofilizada e congelada. Para a purificação da peçonha, alíquotas foram ressuspendidas e submetidas à cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) em coluna de fase reversa (RP) Phenomenex C18, com um gradiente linear binário de solução aquosa de TFA 0,12% (A) e de solução de acetonitrila e TFA 0,1% (B) a um fluxo de 1,0 mL/min. A determinação das massas moleculares de compostos presentes em algumas frações eluídas após 22,00 min foi realizada por um espectrômetro de massa UltraFlex II MALDI-TOF (Bruker Daltonics, Alemanha), com uma solução de ácido a-cyano-4-hidroxicinâmico como matriz. Peptídeos com massa molecular próxima à massa molecular teórica do TcamPI (6302,00 Da), foram parcialmente sequenciados pelo método De novo ou por degradação de Edman.

RESULTADOS:

O fracionamento da peçonha de T. cambridgei por RP-HPLC resultou em 60 frações. Destas, foram analisadas as massas moleculares (MW) dos componentes de 18 frações. Sessenta e três peptídeos tiveram suas massas moleculares determinadas, estando compreendidas de 1.535,12 a 11.517,16 Da. A maioria dos compostos (60,32%) possui MW menor que 6.000,00 Da. Não foi possível identificar nas frações analisadas o componente com MW igual à MW teórica do TcamPI. Um peptídeo com m/z 6.938,50, eluído aos 46,18 min (Tcam46), teve 40 resíduos de aminoácidos de seu N-terminal determinados por degradação de Edman. A sequência parcial foi idêntica a uma sequência predita por cDNA. Este peptídeo, que possui 8 cisteínas, apresentou 65% de similaridade com a ardiscretina, um peptídeo isolado do escorpião T. discrepans capaz de inibir correntes de Na+ em axônio gigante de lula (D'Suze et al., 2004). Assim como a ardiscretina, é possível que o Tcam46 possua uma amidação no resíduo de cisteína no C-terminal. Um peptídeo de 2743,74 Da foi isolado da peçonha e sua sequência parcial mostrou-se idêntica à do peptídeo Tc39 (Batista et al., 2004). Até o momento, entre os peptídeos caracterizados da peçonha de T. cambridgei, nenhum deles teve sua sequência de aminoácidos idêntica ao TcamPI.

CONCLUSÃO:

O possível peptídeo inibidor de protease predito pela sequência obtida pela biblioteca de cDNA não foi encontrado por massa molecular ou sequenciamento de aminoácidos até o momento. A maioria dos compostos purificados e analisados em MALDI-TOF MS possui pontes dissulfeto, o que dificulta sua fragmentação e determinação da sequência De novo. Além disso, devido à pequena quantidade de material, a redução e alquilação dos peptídeos para a posterior separação por RP-HPLC e determinação da sequência de aminoácidos não pode ser realizada. Na continuação do trabalho, as demais frações cromatográficas serão estudadas a fim de se encontrar o TacmPI. Os dois peptídeos parcialmente caracterizados neste trabalho terão suas atividades biológicas determinadas.

Instituição de Fomento: CNPq, FAPDF, FINATEC, DPP-UnB

Palavras-chave: Tityus cambridgei, inibidor de protease, MALDI-TOF MS.