62ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 6. Bioquímica

PURIFICAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E APLICAÇÃO BIOLÓGICA DE UM INIBIDOR DE QUIMOTRIPSINA DE SEMENTES DE Erythrina velutina

Fabíola Rufino 1 Ticiana Amorim 1 Adeliana Oliveira 1 Adriana Uchôa 1 Elizeu Antunes dos Santos 1 Maurício Pereira de Sales 1

1. Departamento de Bioquímica, Universidade Federal do Rio Grande do Norte/UFRN

INTRODUÇÃO:

As sementes de leguminosas são importantes fontes de alimento para populações que vivem em áreas tropicais e subtropicais, sendo o cultivo de leguminosas uma atividade essencial para a sobrevivência humana. As perdas na produção agrícola giram em torno de 37% em conseqüência dos danos causados por pragas e patógenos, tais como insetos, fungos, bactérias e vírus. Para diminuir os prejuízos causados pelas pragas da agricultura, o homem utiliza várias formas de controle. Uma das mais disseminadas é o uso de agrotóxicos. No entanto, o uso exclusivo de pesticidas químicos resulta em rápida seleção de pragas resistentes, afetando também a população de insetos que beneficiam o controle natural de pragas. Uma alternativa para o combate a insetos é baseada na propriedade de certas proteínas em inibir a atividade de enzimas digestórias, reduzindo o desenvolvimento e até levando à morte do inseto-alvo. A prospecção de biomoléculas potencialmente ativas contra pragas tem se voltado para o estudo de plantas não cultivadas da flora brasileira. Considerando isto, os objetivos deste trabalho foram purificar e caracterizar um inibidor protéico de quimotripsina presente nas sementes de Erythrina velutina (mulungu) e analisar sua atividade in vitro sobre enzimas digestórias de insetos.

METODOLOGIA:

As sementes de E. velutina foram pulverizadas e submetidas a um processo de extração em tampão Tris-HCl 50 mM pH 7,5, por 3 h à 25 °C. Após a agitação, o extrato protéico obtido foi centrifugado a 8.000 x g por 30 min a 4 0C. O sobrenadante resultante dessa centrifugação foi denominado extrato bruto (EB). O EB foi submetido a um fracionamento com sulfato de amônio nas seguintes etapas de saturação: 0-30%, 30-60% e 60-90%. A fração com maior atividade inibitória foi submetida à cromatografia de afinidade do tipo Tripsina-Sepharose. As proteínas adsorvidas à coluna foram dialisadas e aplicadas em coluna de Quimotripsina-Sepharose, seguida por cromatografia de fase reversa C-18 em sistema FPLC-AKTA, obtendo-se o inibidor purificado, denominado EvCI. As etapas de purificação foram verificadas quanto a sua atividade inibitória contra quimotripsina. As proteínas foram quantificadas pelo método de Bradford (1976). O EvCI foi caracterizado quanto à sua massa molecular, ponto isoelétrico, presença de isoformas, seqüência N-terminal, estabilidade em diferentes pHs e temperaturas. A atividade inibitória do EvCI foi testada in vitro contra enzimas digestórias de Plodia interpunctella, Anticarsia gemmatalis, Callosobruchus maculatus, Acanthoscelides obtectus e Zabrotes subfasciatus.

RESULTADOS:

O EvCI apresentou massa molecular de 17,89 kDa, determinado por SDS-PAGE. Através de eletroforese bidimensional foram observadas quatro isoinibidores com os seguintes pIs: 4,42; 4,63; 4,83 e 5,06. Seqüências de peptídeos trípticos do inibidor determinadas por MALDI-TOF-MS indicaram alto grau de identidade com inibidores do tipo Kunitz. EvCI mostrou inibição competitiva contra quimotripsina com um Ki de 4 x 10-8 M, mas não inibiu tripsina, elastase pancreática, bromelaína e papaína. O inibidor manteve sua atividade estável quando submetido a variações de pH e temperatura. Na presença de 100 mM do agente redutor DTT durante 120 minutos, o inibidor perdeu 50% de sua atividade, sugerindo a presença de pontes dissulfeto na estabilização da estrutura do sítio reativo do inibidor. Nos testes in vitro realizados para verificar a especificidade do inibidor contra enzimas digestórias de diferentes insetos, este apresentou uma inibição contra enzimas de Plodia interpunctella e Anticarsia gemmatalis (38,89% e 19,50%, respectivamente), mas não houve inibição contra enzimas digestivas de Callosobruchus maculatus, Acanthoscelides obtectus e Zabrotes subfasciatus.

CONCLUSÃO:

A massa molecular, a presença de isoformas com pIs ácidos, e o grau de identidade da seqüência do inibidor purificado de sementes de E. velutina com outros inibidores Kunitz de sementes de leguminosas são indicativos de que EvCI é o mais novo membro de inibidor de quimotripsina da família Kunitz. No entanto é necessária a determinação do N-terminal e comparação com outros inibidores purificados para afirmar que EvCI pertence a essa família de inibidores. EvCI inibe a quimotripsina de modo competitivo e com um Ki da ordem de 10-8 M, mas não apresenta atividade anti-tríptica. A alta estabilidade de EvCI a variações de temperatura e pH e ao agente redutor DTT pode ser devido não apenas a presença de pontes dissulfeto intramoleculares, mas também a presença de inúmeras  pontes de hidrogênio. De acordo com os resultados obtidos nos ensaios in vitro, EvCI tem um grande potencial inseticida sobre os insetos que utilizam proteinases serínicas em seu repertório de enzimas intestinais, podendo ser utilizado como uma ferramenta alternativa no combate a insetos.

Instituição de Fomento: FINEP-Renorbio, CAPES e CNPq

Palavras-chave: Quimotripsina, Inibidor, Sementes.