| 62ª Reunião Anual da SBPC |
| C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 6. Bioquímica |
| PURIFICAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA DE UM INIBIDOR DE QUIMOTRIPSINA TIPO KUNITZ DE SEMENTE DE Erythrina velutina |
| Sheyla Varela Lucena 1 Rafaella Adalgisa Silva do Nascimento 1 Adeliana Silva de Oliveira 1 Jannison Karlly Cavalcanti Ribeiro 1 Giselle Zenker Justo 2 Maurício Pereira de Sales 1 |
| 1. Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN 2. Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP |
| INTRODUÇÃO: |
A natureza constitui uma fonte abundante de produtos biologicamente ativos com propriedades promissoras. Sementes de plantas leguminosas produzem uma grande variedade de proteínas biologicamente ativas, incluindo lectinas, proteínas antifúngicas, inibidores de alfa amilase, arcelinas, proteínas inativadoras de ribossomos e inibidores de proteases. Inibidores de proteases são considerados uma classe de proteínas altamente promissoras como agentes quimioterápicos. Existem evidências de que esses inibidores suprimem vários estágios da carcinogênese, incluindo iniciação, promoção e progressão. Nesse contexto a purificação, caracterização e avaliação do efeito citotóxico em linhagens de células tumorais, de um inibidor de quimotripsina, presente em sementes de Erythrina velutina, é um estudo importante para avaliar uma nova molécula bioativa de origem vegetal como um potencial agente anticarcinogênico. |
| METODOLOGIA: |
| Um inibidor de quimotripsina do tipo Kunitz foi purificado de sementes de Erythrina velutina por fracionamento com sulfato de amônio, cromatografias de afinidade Tripsina-Sepharose, Quimotripsina-Sepharose e cromatografia de Fase Reversa C-18 no sistema FPLC/AKTA. O EvCI foi caracterizada quanto a sua massa molecular, cinética da inibição, ponto isoelétrico, presença de isoformas, estabilidade a agentes desnaturantes físicos e químicos, e especificidade quanto a proteases. EvCl foi avaliado quanto a citotoxicidade em linhagens de células tumorais pelo método de MTT, indução de morte e efeitos sobre o ciclo celular, empregando a marcação com anexina V/PI e análise por citometria de fluxo |
| RESULTADOS: |
| O inibidor, denominado de EvCI, apresentou uma massa molecular de 17 kDa, determinada por SDS-PAGE. A análise por 2D revelou quatro isoinibidores com pIs de 4,42, 4,63, 4,83 e 5,06 todos com massa molecular de 17 kDa. A sequência aminoacídica dos peptídeos oriundos da digestão enzimática de EvCI analisada por MALDI-TOF-MS, apresentou 100% de identidade com o inibidor de quimotripsina ECl de Erythrina variegata. EvCI inibiu competitivamente a atividade de quimotripsina com Ki de 4 x10-8 M, mas não inibiu tripsina, elastase pancreática, bromelaína ou papaína. Contudo, inibiu elastase de neutrófilos em 35,91 %. A atividade inibitória de EvCI sobre quimotripsina foi estável em uma ampla faixa de pH e temperatura. Na presença de 100 mM de DTT por 120 min, o inibidor perdeu 50% de sua atividade. A citotoxicidade do inibidor foi avaliada nas linhagens de células HeLa, MDA, HepG2, K562 e PC3 após exposição a concentrações variando de 0,0005 a 200 μg/mL, por 72 horas. O EvCl inibiu o crescimento celular de células HeLa com um IC 50 de 50 μg/mL. A avaliação de indução de morte celular e efeitos sobre o ciclo celular em células HeLa, indicam que o principal efeito do inibidor é a indução de parada do ciclo celular, sendo, portanto, citostático. |
| CONCLUSÃO: |
O inibidor de quimotripsina purificado de sementes de Erythrina velutina, EvCI apresenta massa molecular de 17 kDa e quatro isoformas com pIs ácidos, a sequência de peptídeos tripticos mostra 100% de identidade com inibidor de quimotripsina de E. variegata. EvCI inibiu quimotripsina de modo competitivo com um Ki da ordem de 10-8 M, e apresentando alta estabilidade a variações de temperatura, pH e ao agente redutor DTT indicando que é um inibidor da família Kunitz. O efeito antiproliferativo de EvCI foi seletivo para linhagens de células HeLa, com um IC50 de 50 mg/mL e a avaliação de indução de morte celular e efeitos sobre o ciclo celular indicam que o inibidor tem um efeito citostático. Esses dados sugerem que o EvCl pode ser um composto promissor para ser estudado no futuro como agente citostático na terapia antitumoral combinada. |
| Instituição de Fomento: CAPES, CNPQ |
| Palavras-chave: Erythrina velutina, HeLa , Kunitz. |