| 62ª Reunião Anual da SBPC |
| C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 6. Bioquímica |
| EFEITO DE UM INIBIDOR DE TRIPSINA DO TIPO KUNITZ DE SEMENTES DE Piptadenia moniliformis NA LIBERAÇÃO DE ELASTASE DE NEUTRÓFILOS HUMANOS |
| Dayse Caroline Severiano da Cunha 1 Luciana Maria Araújo Rabelo 1 Roberta Luciana do Nascimento Godone 1 Rafaela Adalgisa Silva do Nascimento 1 Elizeu Antunes dos Santos 1 Maurício Pereira de Sales 1 |
| 1. Depto. de Bioquímica, Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN |
| INTRODUÇÃO: |
Os Inibidores de proteinases (IP) estão amplamente distribuídos entre bactérias, animais e plantas. Nas plantas, eles apresentam papéis de defesa e regulação e agem como proteínas de reserva. Entre os vários grupos de IP, os inibidores de proteinases serínicas (IPS) são os mais estudados e têm sido isolados de várias sementes de leguminosas. Os IPS são efetivos contra várias enzimas de insetos se tornando uma alternativa aprimorada ao controle de pragas. Outras aplicações têm sido sugeridas, dentre elas a prevenção da carcinogênese. IPS têm sido avaliados no controle da exocitose e secreção de proteinases endógenas, que são etapas características de inúmeras doenças. A exocitose anormal de elastase, proteinase serínica de neutrófilos humanos, é considerada a fonte primária de dano tecidual associado a doenças inflamatórias, tais como enfisema pulmonar, fibrose cística e artrite reumatóide. Compostos que inibem diretamente a elastase ou sua liberação em neutrófilos humanos são de grande interesse no desenvolvimento de novas drogas antiinflamatórias. No presente estudo, avaliamos o efeito de um inibidor da semente de Piptadenia moniliformis, na liberação de elastase de neutrófilos humanos por estímulo com PAF ou fMLP e sua ação no modelo de edema de pata em camundongos. |
| METODOLOGIA: |
As sementes de Piptadenia moniliformis foram obtidas do banco de sementes do IBAMA, Natal-RN. As sementes foram trituradas para obtenção de uma farinha de granulação fina. As proteínas foram extraídas da farinha com tampão Tris-HCl 50 mM pH 7,5. O extrato bruto foi submetido à precipitação por TCA, em seguida as proteínas foram aplicada em uma cromatografia de afinidade Tripsina-sepharose, seguida por cromatografia de troca aniônica Hitrap DEAE FF e cromatografia em gel filtração em coluna de FPLC superose 12, obtendo-se o inibidor purificado, e denominado PmTKI. Todas as etapas de purificação foram acompanhadas por ensaios de atividade anti-elastásica neutrofílica e anti-tríptica. Para caracterização bioquímica do inibidor, foram realizadas análises por SDS-PAGE, análise da interação enzima-inibidor por cinética enzimática, determinação da seqüência N-terminal, avaliação da estabilidade do inibidor em variação de pH e temperatura, determinação do IC50 de PmTKI. O efeito do PmTKI foi investigado sobre a liberação de elastase neutrofílica por PAF e fMLP e sobre edema de pata induzido por carragenana e por elastase em camundongos. |
| RESULTADOS: |
PmTKI, apresentou uma massa molecular de 19,7 kDa por SDS-PAGE. O KI de 1,5 × 10-11 M demonstra que o PmTKI é um inibidor competitivo, inibindo a tripsina em uma relação molar de 1,4 × 10-11 M. A atividade inibitória para tripsina foi estável em uma faixa de pH de 2-12, com uma atividade residual de 80 % a uma temperatura de 100 ºC. O inibidor perdeu 30 % de sua atividade residual na presença de 100 mM de DTT. A sequência N-terminal apresentou identidade com inibidores tipo-Kunitz das subfamílias Mimosoideae e Caesalpinoideae. PmTKI foi efetivo contra elastase de neutrófilos humano com valor de IC50 de 5 µg. A pré-incubação de citocalasina B, neutrófilos, PAF ou fMLP e PmTKI mostrou diferentes inibições na liberação de elastase por PAF, 56% e por fMLP, 42%. Estes resultados mostraram que PmTKI foi preferencialmente um antagonista nos receptores de PAF afetando a liberação de elastase por estímulo de PAF. PmTKI reduziu significativamente o edema de pata induzido por carragenana em 50% e por elastase em 22%. |
| CONCLUSÃO: |
| PmTKI é um inibidor do tipo Kunitz, competitivo para tripsina, estável em uma ampla faixa de pH e temperatura. Apresenta atividade anti-elastásica neutrofílica e foi capaz de inibir ambas as vias de liberação de ENH estimuladas por PAF e fMLP, reduzindo ainda significativamente, o edema de pata induzido por carragenana e elastase tornando-o um forte alvo para o desenvolvimento de drogas e uso em terapias que possam auxiliar doenças inflamatórias crônicas e agudas de caráter infeccioso ou não infeccioso. |
| Instituição de Fomento: CAPES, CNPq. |
| Palavras-chave: Inibidor de Proteinase Serínica, Elastase de neutrófilos humano, PmTKI. |