62ª Reunião Anual da SBPC
C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 1. Biologia Molecular
ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE FATORES DE TRANSCRIÇÃO QUE CONTROLAM A EXPRESSÃO DO GENE GmNRP-B DE SOJA
Murilo Alves Siqueira 1
Daiane Maria Cerqueira 1
Silvana Pinheiro Dadalto 1
Fabiana Freitas Moreira 1
Elizabeth Pacheco Batista Fontes 1
Luciano Gomes Fietto 2
1. Depto.de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal de Viçosa / UFV
2. Prof. Dr./Orientador - Depto.de Bioquímica e Biologia Molecular / UFV
INTRODUÇÃO:
As respostas aos estresses nos organismos são conhecidamente de característica poligênica, ou seja, vários genes devem ser induzidos e outros reprimidos para que ocorra uma resposta efetiva contra um determinado desafio. Os fatores de transcrição controlam a expressão de vários genes ao mesmo tempo e podem ser o ponto de integração entre vias de sinalização que levam ao controle da resposta comum a diferentes estresses. Desta forma, os fatores de transcrição estão entre os principais alvos para o aumento da tolerância de plantas a diferentes estresses ambientais. Em soja, já foi descrito que a expressão do gene GmNRP-B é induzida de forma sinérgica por estresses no retículo e osmótico. Este projeto teve como objetivo principal a prospecção e identificação de fatores de transcrição que controlam a expressão do gene GmNRP-B. Pretendendo-se, assim, elucidar os reguladores chave que integram a resposta a estes dois estresses. Além disto, como a proteína GmNRP-B está relacionada com o processo de morte celular programada, outro objetivo é correlacionar o fator de transcrição identificado neste projeto ao controle da morte celular induzida por estresses em soja.
METODOLOGIA:
A região promotora de GmNRP-B foi identificada em bancos de dados e a partir dela foram construídas fusões de transcrição com os genes repórteres HIS3 e LacZ. Estas construções foram integradas no genoma de leveduras W303, resultando nos transformantes W303-promotorNRP-HIS/LacZ, que foram utilizadas como hospedeiras para transformação com uma biblioteca de cDNA de soja construída no vetor pEXP-AD502. As triagens de possíveis transfatores que se liguem à região promotora do gene de GmNRP-B foram conduzidas pelo sistema mono-híbrido de leveduras. Para isto, células de levedura W303 pré-transformadas com os plasmídeos promotorNRP-HIS/LacZ foram crescidas em meio líquido seletivo com deficiência em uracila e triptofano (SD, Synthetic Dropout, -URA -TRP) por 36 horas, e transformadas com a biblioteca de cDNA de soja, sendo estas transformações crescidas em meio seletivo com deficiência em uracila, triptofano e histidina (SD, Synthetic Dropout, -URA -TRP -HIS). Foram feitas 30 transformações, sendo triados cerca de 4000 clones. A interação dos possíveis transfatores com a região promotora do gene foi verificada pela ativação do gene repórter LacZ e verificação de crescimento em meio de cultura mínimo sem histidina, segundo protocolo da Clontech.
RESULTADOS:
A varredura de uma biblioteca de soja pelo sistema do mono-híbrido possibilitou a seleção de nove clones. Destes nove, apenas um manteve-se positivo após um novo evento de transformação. Experimentos de interação utilizando o promotor de Bip demonstraram que a interação do clone positivo é específica com o promotor de GmNRP-B. O sequenciamento do DNA do clone positivo e a comparação de sua seqüência com o banco de dados do Phytozome identificou um gene que codifica uma proteína similar à ERD15 de Arabidopsis. O gene identificado foi denominado GmERD15 e a seqüência de aminoácidos deduzida mostrou que a proteína possui um domínio conservado de interação com proteínas que se ligam à cauda poli-A de mRNAs (PABP). A busca por seqüências similares no banco de dados do Phytozome mostrou que o gene encontra-se duplicado no genoma da soja e que além dos dois genes, outros quatro constituem esta família gênica em soja. Análises de comparação da seqüência de aminoácidos deduzida com ortólogos ERD15 de diversos organismos mostraram que GmERD15 possui o domínio de interação com PABP conservado em sua porção amino-terminal e uma porção carboxi-terminal divergente. A análise do agrupamento destas proteínas mostra que podemos dividir esta família de proteínas em pelo menos 3 subfamílias.
CONCLUSÃO:
Os resultados indicam que GmERD15 atua no controle da expressão do gene GmNRP-B, revelando uma nova família de transfatores que atuam no controle da expressão de genes em plantas.
Instituição de Fomento: FAPEMIG; CNPq; CAPES.
Palavras-chave: Soja, Fatores de transcrição, Mono-híbrido.