62ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 1. Biofísica - 3. Biofísica Molecular

ESTUDO DOS DOMÍNIOS C-TERMINAL DAS SEPTINAS HUMANAS 6 E 7

Ivo de Almeida Marques 1 Napoleão Fonseca Valadares 1 Wanius José Garcia da Silva 1 Richard Charle Garratt 1

1. Grupo de Cristalografia, Instituto de Física de São Carlos - IFSC/USP

INTRODUÇÃO:

Septinas constituem uma conservada família de proteínas de ligação a nucleotídeo de guanina, inicialmente identificadas em leveduras, sendo posteriormente encontradas em outros eucariotos, com exceção de plantas. As sequências de todos os membros desta família podem ser divididas em três domínios: um domínio N-terminal variável, um domínio central GTPase e um domínios C-terminal, geralmente predito como coiled-coil. Hoje, sabe-se que tais proteínas estão relacionadas com diversos processos celulares, por exemplo, exocitose e citocinese. Em humanos, além do seu papel fisiológico, algumas septinas estão relacionadas a casos de patologia, como câncer e doenças neurodegenerativas. A principal característica da família está na capacidade de formarem filamentos compostos por septinas diferente. Em 2007, Sirajuddin et al apresentaram a primeira e única estrutura cristalográfica de um complexo de septinas, do complexo formado pelas septinas 2, 6 e 7. É importante observar que os domínios C-terminal, embora presentes, não apresentam densidade eletrônica no cristal. Assim, a estrutura não traz informações sobre tais partes do filamento. O presente trabalho visa especificamente a caracterização estrutural dos domínios C-terminal das septinas 6 e 7, nomeados por 6C e 7C, respectivamente.

METODOLOGIA:

Os domínios C-terminal das septinas 6 e 7 foram clonados no vetor pet28a(+), gerando construções fusionadas com His-tag, e expressos em Escherichia coli BL21(DE3). Para purificação, utilizou-se cromatografia de afinidade por níquel, coluna Ni-NTA. Para o domínio 7C utilizou-se também cromatografia de troca catiônica. Os His-tags das construções foram clivados com Trombina protease, 20U/mg a 4ºC. Após as reações de clivagem, as amostras foram aplicadas novamente em coluna de níquel, Ni-NTA, e em coluna de benzamidina, para retirada dos His-tags livres e da trombina, respectivamente. Para as análises estruturais, de interações e de estabilidade utilizaram-se as técnicas de ressonância plasmônica de superfície (SPR), ultracentrifugação analítica, dicroísmo circular (CD), filtração em gel e cross-linking químico.

RESULTADOS:

Os domínios 6C e 7C foram obtidos com sucesso, cerca de 40 e 6 mg/L, respectivamente, sendo seus graus de pureza atestado por tricina-SDS/PAGE 16%. Os resultados de cross-linking químico indicam que ambos os domínios são capazes de formar homodímeros em solução e que, quando juntos, não formam estruturas de estado de oligomerização maior que dímeros. No entanto, os resultados de gel filtração indicam, na aproximação globular, massas compatíveis para trímero e tetrâmeros. Assim, em conjunto com os dados de cross-linking químico, temos indícios de homodímeros de forma não globular. Os dados de CD indicam alto teor de estrutura secundária do tipo alfa-hélice para ambos os domínios. Em uma preparação equimolar dos domínios o teor de alfa-hélice se mantém, mas, observamos aumento na estabilidade térmica, indicando interação entre os domínios. Contudo, os ensaios de cross-linking químico e ultracentrifugação analítica indicam apenas dímeros. Por fim, os dados de SPR indicam maior afinidade para as heterodimerização que para as homodimerizações, e a constante de dissociação no equilíbrio (KD) para a heterodimerização determinada por SPR é 15,8 nM.

CONCLUSÃO:

Os domínios C-terminal das septinas 6 e 7 foram expressos e purificados de forma solúvel em sistema heterólogo, E. coli. Os dados indicam que os domínios individualmente formam homo-dímeros de forma não globular e com alto teor de estrutura secundária do tipo alfa-hélice. Quando misturados equimolarmente formam heterodímeros também de forma não globular, mantendo o teor de alfa-hélice, contudo com maior estabilidade térmica do que os homodímeros. Via SPR, obtivemos o valor de 15,8 nM para a constante de dissociação do heterodímero. Por fim, nossos resultados indicam que, embora não sejam necessários para a formação do complexo de septinas, os domínios C-terminais das septinas 6 e 7 possuem a função de aumentar a estabilidade do complexo. Os domínios C-terminal de septinas são, em geral, preditos como coiled-coil, no entanto, tais predições são baseadas apenas nas estruturas primárias. O presente trabalho é o primeiro a apresentar dados experimentais que corroboram as predições teóricas quanto à estrutura de tais domínios.

Instituição de Fomento: CAPES e FAPESP

Palavras-chave: Septinas, SPR, Cross-linking.