62ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 6. Bioquímica

ADAPTAÇÃO PARA SISTEMA DE MICROTITULAÇÃO DO MÉTODO DE SOMOGYI-NELSON PARA ANÁLISE METAGENÔMICA DE ENZIMAS QUE DEGRADAM FUCANAS

Rafael Barros Gomes da Câmara 1 Ruth Medeiros de Oliveira 1 Raniere Fagundes de Melo Silveira 1 Rita de Cássia Barreto da Silva 2 Lucymara Fassarella Agnez Lima 2 Hugo Alexandre de Oliveira Rocha 1

1. Depto. de Bioquímica, Universidade Federal do Rio Grande do Norte / UFRN 2. Depto. de Biologia Celular e Genética, UFRN

INTRODUÇÃO:

Fucanas são polissacarídeos sulfatados com grande potencial farmacológico. Seu emprego para este fim, no entanto, ainda não foi efetivado devido a sua alta massa molecular. Há poucos relatos de endoenzimas que agem sobre estes e uma alternativa para contornar essa problemática é o uso da metagenoma, técnica que se baseia na extração de DNA ambiental e inserção deste em bactérias cultiváveis para que se tenha acesso a enzimas de organismos não cultiváveis, e assim se identificar fucanidases. Porém, um dos problemas da análise metagênomica de glicosidases é a falta de métodos que possam ser utilizados para a identificação de suas atividades quando há um grande número de amostras e quando estas estão em pouca quantidade. Um método bastante confiável seria o de Somogyi-Nelson, método que quantifica a presença de açúcares redutores, produtos que surgem da ação das glicosidases. Entretanto, ele requer grandes volumes de reagente e amostra. Uma solução seria a adaptação deste para sistema de microtitulação. Assim, o principal objetivo deste trabalho foi adaptar o método de Somogyi-Nelson para uso em microplacas e aplicá-lo em pesquisas metagenômicas que visem à descoberta de enzimas que degradem fucanas, bem como outros polissacarídeos.

METODOLOGIA:

Objetivando identificar novas fucanidases, utilizuo-se uma biblioteca metagenômica elaborada pela extração, purificação, fragmentação e ligação ao pBISK, de DNA genômico ambiental. Cepas de E. coli (DH10b) foram transformadas por eletroporação e cultivadas em microplacas de 96 poços contendo meio mineral com fucana por 18 horas, sob agitação e temperatura de 37 °C. Cepas não transformadas e transformadas (com pBISK sem inserto) foram utilizadas como controle negativo. Posteriormente, os meios de cultivo foram obtidos por centrifugação. Estes foram submetidos à dosagem de açúcares redutores utilizando o método de Somogyi-Nelson, adaptado por nosso grupo, para uso em microplacas. Para essa adaptação, aspectos como tipo de microplaca, tampão do reagente de cobre, forma, tempo e temperatura de aquecimento foram avaliados para a obtenção das melhores condições. Os clones que tiveram aumento do teor de açúcares redutores no meio em que haviam sido cultivados foram submetidos à MINIPREP. O DNA plasmidial foi analisado por eletroforese em gel de agarose 0,7% e as sequências nucleotídicas, obtidas após PCR seguida de seqüenciamento automático. Estas foram analisadas in silico utilizando a ferramenta BLAST em busca de similaridade com sequências disponíveis no banco de dados do NCBI.

RESULTADOS:

A escolha das melhores condições para o uso do método em microplacas foi realizada após análises estatísticas e dos valores dos coeficientes de determinação (R2) das curvas geradas. Verificou-se que três protocolos utilizando microplacas de reação, tampão fosfato e 10 minutos de aquecimento em termociclador, foram os que apresentaram melhores resultados. Com aquecimento a 70 °C foi possível se detectar 5-250 μg de açúcar redutor. Com 55 °C se detecta quantidades entre 100-2000 μg. E para valores entre 400-5000 μg recomenda-se aquecimento a 50 °C. Utilizando este método para avaliar clones de uma biblioteca metagenômica cultivados em meios contendo uma fucana como única fonte de carbono, identificou-se um aumento de 30% no teor de açúcares redutores nos meios em que dois clones (denominados C5 e D6) foram cultivados. A análise in silico das sequências destes mostraram similaridade com glicosil hidrolases.

CONCLUSÃO:

A adaptação, aqui proposta, do método de dosagem de açúcares redutores de Somogyi-Nelson para o sistema de microtitulação mostra uma grande plasticidade e adaptabilidade a uma grande variedade de condições experimentais. Utilizando os protocolos propostos, foi possível aumentar os limites de detecção do método original, que estavam num intervalo de 10-600 μg, para 5-5000 μg utilizando um volume final de apenas 300 μL, gerando, desta forma, uma economia substancial de amostras e reagentes, além da possibilidade de automatização das leituras dos resultados, fatores de grande interesse e viabilidade para o seu uso em laboratórios de pesquisa, como também, e principalmente, em laboratórios industriais. O aumento do teor de açúcares redutores nos meios onde foram cultivados clones de bibliotecas metagenômicas que apresentaram similaridade com possíveis atividades de glicosil hidrolases mostra que esta metodologia se mostra promissora e viável para a pesquisa de atividades enzimáticas sobre polissacarídeos, utilizando esta nova ferramenta biotecnológica.

Instituição de Fomento: CAPES, CNPq e MCT

Palavras-chave: Glicosidases, Fucoidan, Metagenoma.