62ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 10. Microbiologia - 2. Microbiologia Aplicada

BIOPROSPECÇÃO DE PROCARIOTOS METANOGÊNICOS EM MANGUEZAIS DA BACIA PETROLÍFERA POTIGUAR

Larissa Bahia Magalhães 1 Márcia Danielle de Araújo Dantas 1 Paulo Sérgio Marinho Lúcio 1 Carlos Alfredo Galindo Blaha 2

1. Universidade Federal do rio Grande do Norte - UFRN 2. Prof. Dr./Orientador - Depto. de Biologia Celular e Genética - UFRN

INTRODUÇÃO:

Os microrganismos capazes de biodegradar os hidrocarbonetos do petróleo estão largamente distribuídos pelos oceanos. Dentre os microrganismos biodegradadores, encontram-se as bactérias metanogênicas, onde a maioria utiliza compostos contendo um carbono como fonte de energia para sintetizarem metano. As espécies dos gêneros Methanosarcina e Methanosaeta são capazes de metabolizar um dos ácidos orgânicos mais abundantes nos ambientes contendo petróleo: o acetato, processo conhecido como metanogênese acetoclástica. A metanogênese predomina em ambientes marinhos onde o sulfato está depletado, os quais incluem sedimentos que recebem grandes quantidades de matéria orgânica. O bioma mangue é um ambiente ótimo para esperar uma elevada biodiversidade microbiana autoctona, sujeita a variações intrínsecas da interface com os oceanos. Do ponto de vista de estratégias preventivas o conhecimento dessa riqueza natural torna este trabalho pioneiro na bioprospecção de metanógenos. O presente estudo tem como objetivo realizar avaliações in silico das vias metabólicas de geração de metano visando à seleção de um biomarcador molecular para estudos de bioprospecção metagenômica em amostras de manguezais da Bacia Petrolífera Potiguar da diversidade nativa de microorganismos metanogênicos.

METODOLOGIA:

Os primers escolhidos utilizando as ferramentas de bioinformática do NCBI e edição manual basearam-se no gene cdhC de espécies metanogênicas do gênero Methanosarcina. As amostras de DNA metagenômico (DNAm) já foram obtidas do banco de metagenomas do Cluster for Research on Oil Biotechnology do LGMP-DBG/CB (UFRN). A PCR foi realizada no termociclador (Eppendorf - Master cycle gradient), utilizando-se o programa de ciclagem de PCR DOWNTM para os primers cdhC. A reação de PCR otimizada com um volume final de 20 µl, foi a seguinte: 10,5 µl de água Milli Q, 1 µl (~40ng) de DNA metagenômico, 2 µl de Primer cdhC Forward (20 pMol), 2 µl de Primer cdhC Reverso (20 pMol) e, 1 µl de dNTP´s (0,5 mM), 1 µl de MgCl2 (2,5 mM), 4µL de tampão de PCR5X (Promega), e 0,5 µl (2 unidades) da enzima Taq polimerase (Promega). As reações de PCR para o gene cdhC foram analisadas em géis de agarose a 1,5% e em géis de PAGE a 12%; colorados com brometo de etídio 0,5μg/ml e visualizados em transiluminador de UV. Após coloração os géis foram fotografados para análises dos perfis de bandas.

RESULTADOS:

A partir dados de genes relacionados com a metanogênese acetoclastica e pelos dados relacionados com ambientes de reservatório e a ocorrência elevada de acetatos em diversos sedimentos foi escolhido o gene cdhC para ser avaliado como biomarcador para detecção de microorganismos metanogênicos nas amostra da coleção de metagenomas de manguezais do nosso laboratório. A partir do DNAm foi possível realizar a técnica de PCR, onde observou-se a ocorrência de amplificação com os primers cdhC, com o produto de PCR de tamanho esperado (~400 bp). Observa-se também um fragmento de PCR menor do que o fragmento esperado como foi também relatado na literatura. Esta variação no tamanho do amplicon provavelmente esta relacionada com a biodiversidade intrinsica do DNAm. O amplicon de ~400bp apareceu apenas no DNAm Diogo Lopes 120 dias, não sendo evidenciada no DNAm Diogo Lopes 60 dias. Isso sugere que os metanógenos acetoclásticos necessitariam de cerca de 120 dias de adaptação. O fragmento de tamanho menor foram observadas nas duas amostras, sugerindo uma variação nos DNAm contaminados com petróleo. Nos metagenomas de Areia Branca os resultados foram similares exceto que o amplicon de ~400bp foi observado preferencialmente nas amostras contaminadas com petróleo.

CONCLUSÃO:

Foi construído um banco de dados com as seqüências nucleotídicas do gene cdhC e com as seqüências protéicas da proteína CdhC, envolvida na conversão do acetato a CH4. Os primers desenhados para o gene cdhC permitiram implementar e otimizar um protocolo para o screening molecular através da técnica de PCR, em amostras de metagenoma.Nossos resultados sugerem a ocorrência de metanógenos acetoclásticos nas amostras de DNA metagenômico do mangue de Diogo Lopes RN após 120 dias, contaminação com petróleo assim como também em Areia Branca preferencialmente contaminada. Os produtos de PCR obtidos sugerem uma diversidade microbiana de microbianas de microrganismos metanogênicos com capacidades intrínsecas de responder a contaminação por petróleo. Esta diversidade será explorada através de PCR-DGGE.

Instituição de Fomento: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq

Palavras-chave: Metanogênese, Petróleo, Microorganismos.