62ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 1. Biologia Molecular

CONSTRUÇÃO DE BIBLIOTECA SUBTRATIVA DE cDNA EM CANA-DE-AÇÚCAR SUBMETIDA A ESTRESSE HÍDRICO

Helaine Cristiane Silva 1 Ana Lívia de Jesus Oliveira e Melo 1 Kellya Francisca Mendonça Barreto 1 Rosa de Lima Silva 1 Rykson Ramonn Rodrigues de Vasconcelos 1 Katia Castanho Scortecci 1

1. Depto.de Biologia Celular e Genética - UFRN

INTRODUÇÃO:

O cultivo da cana-de-açúcar tem uma inquestionável importância histórica, econômica e social para o Brasil. A cana cultivada nos campos brasileiros é um híbrido pertencente à família Poaceae e recebe a designação de Saccharum ssp. Essa importância é crescente devido principalmente à utilização de sua biomassa para a produção de etanol, açúcar, vinhoto e bagaço. Atualmente a preocupação de alguns países em reduzir a emissão de poluentes, resultado da queima de combustíveis fósseis, tem aumentado as exportações do etanol brasileiro impulsionando o crescimento do setor, daí a importância de pesquisas que visem identificar os fatores que influenciam a cultura de cana-de-açúcar no Brasil. Sabe-se que um dos fatores limitantes para qualquer cultura é a escassez de água. Posto isto, essa pesquisa vislumbra identificar como o estresse hídrico influencia no cultivo da cana-de-açúcar, incluindo a verificação de genes diferencialmente expressos nas plantas submetidas à condições de estresse hídrico, através da construção de uma biblioteca subtrativa. Compreender como a escassez de água influencia o desenvolvimento da cana-de-açúcar é de grande relevância, podendo apontar soluções para o aumento da produção, principalmente nos estados nordestinos que são tão afetados pela seca.

METODOLOGIA:

A cana utilizada na realização destes experimentos foi coletada nos campos na usina Estivas (localizada em Goianinha-RN) e, em seguida, plantadas em bandeja, tendo como substrato vermiculita e composto orgânico. Foram utilizadas duas variedades híbridas: uma resistente e outra sensível à privação de água. As plantas foram separadas em dois grupos: um controle, regado normalmente, e outro destinado ao tratamento de estresse hídrico. O último grupo foi submetido à seca durante, 5, 10, 15 e 20 dias. Foram retiradas raízes, folhas e meristema para a extração de RNA utilizando Trizol, de acordo com as instruções do fabricante. Após essa etapa a biblioteca subtrativa foi construida utilizando os kits da Clontech: Super SMARTTM PCR cDNA Synthesis e o PCR-Select TM cDNA Subtraction. Em seguida o material obtido foi clonado no vetor pGEM T-easy (Promega), e subsequentes transformações por eletroporação nas cepa competentes DH10B de Escherichia coli. As colônias brancas obtidas foram selecionadas e DNA foi obtido após mini-preparaçaõ. Uma parte do material foi submetido a digestão utilizando a endonuclease de restrição EcoRI. Este DNA plasmidial também foi submetido a PCR para preparo do material para o sequenciador automatico MegaBAce (GE).

RESULTADOS:

Na análise morfológica das duas variedades objetos deste estudo submetidas ao estresse hídrico, não foram observadas alterações para os grupos retirados no quinto dia de tratamento. Já para os grupos retirados no décimo dia de seca, verificou-se que para a variedade sensível, 30% das plantas apresentaram fechamento e amarelecimento das folhas, enquanto na variedade resistente essas alterações praticamente não foram observadas. As plantas sensíveis não suportaram mais de dez dias de tratamento e morreram, enquanto que as resistentes a estresse hídrico só apresentaram amarelecimento e fechamento das folhas após o 15º dia de privação de água. O fechamento reduz a perda de água por evaporação e transpiração, uma vez que diminui a área foliar, aumentando a disponibilidade de água para as folhas restantes. De modo a identificar as possíveis mensagens em resposta a estas condições de estresse foram construidas duas bibliotecas subtrativas utlizando folhas de plantas controle e de plantas privadas de água por 10 dias. Foram selecionados 30 clones de cada biblioteca para serem digeridos com a endonuclease de restrição EcoRI. O resultado obtido mostrou que os fragmentos obtidos variaram entre 400 e 600 pb, sugerindo que estes clones obtidos apresentam tamanhos variáveis de inserto.

CONCLUSÃO:

Haja vista os resultados observados, pode-se concluir que a privação de água desencadeou respostas morfológicas e fisiológicas, influenciando, pois, o desenvolvimento. Verificou-se, também, a presença de diferentes fragmentos de cDNA que, possivelmente, correspondem a variados genes expressos diferencialmente em resposta ao estresse hídrico.

Instituição de Fomento: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq

Palavras-chave: Cana-de-açúcar, Biblioteca subtrativa, Estresse hídrico.